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alanyatou

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物设计及PCR相关问题已有2人参与

各位，本人研三，之前师姐师兄在的时候好多问题没搞明白他们就毕业了，最近有问题，只能上小木虫求助一下。
最近在做酶的克隆表达，想从筛选到的菌株中钓取酶基因，之前设计了一对引物，特异性不是很好，可能有错配，导致PCR产物有非特异性条带，之后做过目的条带胶回收之后作为模板，也做过退火温度梯度，还降低过模板量和引物浓度，都没有特别好的单一条带的结果。于是纠结是不是要重新设计一对引物，这次换了个目的条带，用PP5设计的引物，至少保证了不加酶切位点的时候没有错配，可是发现不加酶切位点的时候评分可以达到100，但是加了酶切位点之后就又出现了二聚体和发卡。情况大概介绍完了，总结一下要问的问题：
1．        加酶切位点之后评分降低，怎么解决？可以直接用吗？还是需要做一些调整？另外加了酶切位点之后，产生了一个六个碱基左右的错配，这样的引物还能用吗？可是错配中有四个碱基是由酶切位点引起的，而我现在没办法换酶切位点，怎么解决？
2．        两个引物之间Tm值和GC比相差较大？如何解决？如果用同义密码子进行替换，是否会对引物的特异性产生影响。
3．        之前做二次PCR的时候，做了个温度梯度，同时平行做了两管，出现了一管有条带，另一管全是抹带，一会上图，大家给鉴定一下原因呗？DL2000 marker 之后四个分别是退火温度为48,50,52,54. 左右两块胶是平行的两管。
4．        最近跟老师讨论PCR，他说我的操作不规范，应该将每种东西都打到侧壁上，之后用手指轻弹管壁，用溅起的水珠将壁上的液滴冲洗下去，离心后再进行PCR，而我之前的做法都是加完水之后将所有东西都加到液面以下，老师说我们的枪头不是进口的，会带出来一些液体，想问一下大家都是怎么做的？两种方法有很大差异吗？
5．        看到有人说可以拿设计的引物在NCBI上blast一下，研究了许久，都未成功，可否有哪位大神指点一下具体步骤？
6．        想问一下正引物这样的，在酶切位点之前加了两个保护碱基，翻译的时候是否会引起位移？另外，大肠杆菌表达的时候是否利用TTG当起始密码子的比较少？第一次设计的引物是：
正：5'> CGGGATCCATGTTGTCTAGACGTCGTATCG <3'
反：5'> CCCAAGCTTTCAACAGTACAGGTTGCCG <3'
目的片段是：
TTGTCGAGACGCCGTATCGCCGCCGTCACCGCCGCCCTCGTCCTCGCCGGAAGCGCCCCGATGCTGCTCCCCGCCGCGGCCACCACCGCCTCGGCCGCCACCGCGGCCGCGTGTTCTAGCTACCCCGCCTGGGTCGCCGGACAGTGGTACGAGGCCGGTGCGATCGTCCGTTACACCGACGGCAAGGCGTACATCGCCGAGCACGCCAACCCGGGTTACGACCCGACCGTCAGCACCTGGTACTGGGAGCCCTACGCCTGTGACAACGGGCCCGGGACGCCCGTCGGGAACTTCGTCGTGACCGAGGCACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAACCGGAACCCCTTCTACACCTACAGCGGCCTCACCGCCGCGCTCAGCGCCTACCCCGGCTTCGCCAACACCGGGAGCGACACGGTGAAGAAGCAGGAGGCCGCCGCCTTCCTCGCCAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGTCTGGTCCACGTCGTGGAGCAGAACCAGGCCAACTACCCGCACTACTGCGACTGGGGCCGGCCGTACGGCTGCCCGGCCGGCCAGGCCGCCTACTACGGGCGCGGTCCCATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCGGGCGACGCGTTGGGCATCGACCTGCTGAACAACCCCTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCCGTCGCCTGGAAGACCGCCCTCTGGTACTGGAACACCCAGACCGGTCCGGGCAGCATGACCGGCCATGCCGCCATGGTGAACGGGGCCGGTTTCGGCCAGACGATCCGCAGCATCAACGGCTCGCTGGAGTGCGACGGCAGGAACCCGGCGCAGGTCCAGAGCCGGGTGACGAAGTACCAGCAGTTCACCCAGATCCTCGGGACGACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA
7.第二次设计的引物是：
正：5'> CGCGGATCCATGCCATCCCCCCACCGCT<3'
反：5'> CCCAAGCTTCTACCGGATGGCCTTGAT<3'
目的片段是：ATGCCATCCCCCCACCGCTCCCGCACGCTGCGGGCGCTCGTGTCCGCCGCCTGTACCGCCGTGCTCGGCGCCGGACTGCTCGCCGGCACGGGCGCCTCGACCGCCACCGCGGCGACCTCGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGGTTCGAAGGTCGTCGGCTACTTCACCGAATGGGGCACCTACGACCGGCAGTACTACGTCAGGAACATCGAGACGTCCGGGTCCGCGGACCGGCTCACCCACATCAACTACGCCTTCGGCAACGTCACCGGCGGCAAGTGCGCCATCGGCGACGCCTACGCGGCCACCGACCGCGCCTACACCGCCGAGGAGTCCGTCGACGGAGTCGCGGACACCTGGGACCAGCCGCTGCGCGGCACCTTCAACCAGCTGCGGAAGCTGAAGGAGAAGCACCCCGGCCTCAAGGTGATCTGGTCCTTCGGCGGCTGGACCTGGTCCGGCGGCTTCGGCGAGGCCGCGAAGAACCCGGCCGCCTTCGCGCAGTCCTGCCTGGACCTGGTGGAGGACCCGCGCTGGGCCGGCGTCTTCGACGGCATCGACATCGACTGGGAGTACCCGAACGCCTGCGGCGCCACCTGCGACACCAGCGGCCGTGACGCCTACCGCGAACTGATGGCGGCGCTGCGCTCCACGTTCGGCCCCGACCGGCTGGTCACCGCCGCGATCCCGGCCGACGCCACCGACGGCGGCAAGATCGACGCGGCCGACTACGCCGGCGCCGCCCCGTACGTCGACTGGTACAACCCGATGACGTACGACTTCTTCGGCGCCTGGGACACCGCCGGGCCGACCGCCCCGCACTCGCCGCTGACCTCGTACGACGGCATCCCGAAGGCGGAGTACCACAGCGCCGCCACCATCGCGAAGCTGACCGGTCTCGGCGTCCCCGCGGACAAGCTGCTGCTCGGCATCGGCTTCTACGGCCGCGGCTGGACCGGCGTCACCCAGGCGGAGCCGGGCGGCACCGCGACCGGCCCCGCGCCGGGCACGTACGAGGCGGGGATCGACGACTACAAGGTCCTCAAGGACAGGTGCCCCGCGACCGGCACGGTCGGCGGCACCGCCTACGCCCGGTGCGGCGACCAGTGGTGGAGCTACGACACCCCGGAGACCGTCGCCTCCAAGACGGAGTGGAAGAACCAGCAGGGCCTCGGCGGCACGTTCTTCTGGGAGCTCAGCGGCGACACCGCGAACGGTGAGCTGATCAAGGCCATCCGGTAG

引物设计及PCR相关问题


引物设计及PCR相关问题-1
退火温度梯度.JPG
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1楼2015-12-10 22:40:09
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alanyatou

新虫 (初入文坛)
第一张图是之前做的酶切，顺便问一下，顺序是DL2000，BAM H1 单酶切，hind3 单酶切，接着是双酶切，最后为DL15000,为什么我的单酶切，两条带的大小不太一样？BAM H1 单酶切是30℃做的，hind3 单酶切和双酶切是37℃做的。
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2楼2015-12-10 22:43:36
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404991634

至尊木虫 (著名写手)
与其卡在这里，不如交给公司设计，花不了多少钱，不然会影响你实验进度

发自小木虫Android客户端
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无所畏惧
3楼2015-12-10 23:50:50
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 可以用，酶切位点对你片段的扩增没有任何影响啊。但要注意一点，你是做表达，所以序列要对框，也就是如果你的蛋白前边有标签或者从载体序列开始翻译，要保证能够跟你的蛋白ORF对上。
2.可以通过增加酶切位点的保护碱基来进行调节。
3.PCR有些扩不出来原因比较难说，但你有的样本能出来，说明体系问题不大。建议不要纠结失败的原因，用括出来的片段继续往前走，保持实验进度推进。
4. 我认为你的做法是对的，而且我也是这么做的，没啥问题。注意先配好缓冲体系，其他成分逐步往里加。
5. 直接去NCBI 的blast就可以，选类型（蛋白or核酸），物种等，然后SUBMIT
6. 保护碱基不会引起突变，因为酶切的时候都切掉了啊。起始密码子是ATG，没听说过TTG。

希望有所帮助。
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4楼2015-12-11 09:57:11
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草蔻年华

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.评分降低没有关系啊，十全十美的引物很少，能扩出你的片段就行。至于你的错配碱基，为什么不能换酶切位点，表达载体一般不都好多个酶切位点吗？真不能换那就只能这样了。
2.两个引物之间Tm值比较大的话，可以用touch down程序跑。
3.退火温度我最低用过50度，温度越低，引物的特异性结合越差，可以试试提高退火温度，比如60度。
4.你老师说的很对，但我觉得影响不大，按照你的方法加的话，你加完后可以用枪头稍微吹打几下再离心。
5.我也没做过引物比对。。。
6.保护碱基切掉了不影响。TTG的起始密码子？没听说过啊，可能我孤陋寡闻了
最后，有杂带不要紧啊，里面只要有你的目的条带就行，你最终不是要做蛋白表达吗？把大小符合的条带切下来回收测序，做连接转化表达就是，何必纠结pcr的条带单一不单一？
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5楼2015-12-11 12:18:56
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alanyatou

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by uulovelyuu at 2015-12-11 09:57:11
1. 可以用，酶切位点对你片段的扩增没有任何影响啊。但要注意一点，你是做表达，所以序列要对框，也就是如果你的蛋白前边有标签或者从载体序列开始翻译，要保证能够跟你的蛋白ORF对上。
2.可以通过增加酶切位点的保 ...

请问一下， 从图中其实可以看出我的PCR产物除了目的条带（大约在1200左右）以外，100以及再往上一点还是有非目的条带的，这样的可以用来测序吗？是不是会对测序结果产生影响？
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6楼2015-12-11 13:34:47
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by alanyatou at 2015-12-11 13:34:47
请问一下， 从图中其实可以看出我的PCR产物除了目的条带（大约在1200左右）以外，100以及再往上一点还是有非目的条带的，这样的可以用来测序吗？是不是会对测序结果产生影响？...

可以切胶测序的。
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7楼2015-12-11 14:36:55
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alanyatou

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 草蔻年华 at 2015-12-11 12:18:56
1.评分降低没有关系啊，十全十美的引物很少，能扩出你的片段就行。至于你的错配碱基，为什么不能换酶切位点，表达载体一般不都好多个酶切位点吗？真不能换那就只能这样了。
2.两个引物之间Tm值比较大的话，可以用t ...

退火温度我是根据公司送来的引物上的Tm值估算的，两条引物分别是59.2和57.6，减了三到五度当做退火温度，也做过温度梯度，不过最高是54，而且没有条带，是不是我的引物特异性不好，所以导致温度太高的时候引物不与模板结合了？这样的话60度还有尝试的必要吗？
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8楼2015-12-11 16:43:40
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alanyatou

新虫 (初入文坛)
有没有哪位大神能出来继续给指点一下啊？帖子都要沉了~~
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9楼2015-12-14 20:19:50
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