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liling0601

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[求助] 载体构建已有3人参与

我通过高保真酶扩的两个4000+bp的序列，但是怎么都连接不到PGBKT7，或者Pcambia1301的载体上，麻烦有经验的各位给点建议，我用的是takara的T4连接酶，16度16小时或者24小时 4度过夜或者3天都连过，就是连不上，连上的菌液验证不出来，酶切多了个三千的条带或者是提出的质粒木有条带

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1楼 2015-11-30 11:10:03

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liling0601

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引用回帖:

3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的，你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点，然后用相同酶将质粒载体酶切一下，然后再连（给目的片段加酶切位点时， ...

我的菌液PCR结果，这里有三个基因（每个挑8个单菌落）连在PGADT7上的，后面两个基因老连不上，割胶回收的浓度13左右，但是连接体系做了20微升，而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带