24小时热门版块排行榜    

查看: 1944  |  回复: 18

liling0601

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有3人参与

我通过高保真酶扩的两个4000+bp的序列,但是怎么都连接不到PGBKT7,或者Pcambia1301的载体上,麻烦有经验的各位给点建议,我用的是takara的T4连接酶,16度16小时或者24小时 4度过夜或者3天都连过,就是连不上,连上的菌液验证不出来,酶切多了个三千的条带或者是提出的质粒木有条带
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我只能说如果片段长了不好连接到载体上,可以在片段中部寻个酶切位点分开两段依次连接,我只是提供个思路,具体实验流程还要好好谋划谋划,我没有连过这么长的。
没有做不到,只有想不到!
2楼2015-11-30 11:51:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Demon黄

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
就如楼上所说的,你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点,然后用相同酶将质粒载体酶切一下,然后再连(给目的片段加酶切位点时,关键是看质粒载体上有没有这两个酶的酶切位点)。
3楼2015-11-30 18:40:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的,你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点,然后用相同酶将质粒载体酶切一下,然后再连(给目的片段加酶切位点时, ...

我的片段两端都加好酶切位点的,跟载体上一样的
4楼2015-12-01 13:49:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的,你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点,然后用相同酶将质粒载体酶切一下,然后再连(给目的片段加酶切位点时, ...

我的菌液PCR结果,这里有三个基因(每个挑8个单菌落)连在PGADT7上的,后面两个基因老连不上,割胶回收的浓度13左右,但是连接体系做了20微升,而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带
载体构建
P51201-133853.jpg

5楼2015-12-01 13:54:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)

我的这两个基因目的条带666bp
6楼2015-12-01 13:55:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Demon黄

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by liling0601 at 2015-12-01 13:49:58
我的片段两端都加好酶切位点的,跟载体上一样的...

那一般都能连接的上的呀,连接酶应该是没问题的吧
7楼2015-12-01 16:18:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-01 16:18:46
那一般都能连接的上的呀,连接酶应该是没问题的吧...

没有啊,新买的,takara的

发自小木虫Android客户端
8楼2015-12-01 16:29:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-11-30 11:51:19
我只能说如果片段长了不好连接到载体上,可以在片段中部寻个酶切位点分开两段依次连接,我只是提供个思路,具体实验流程还要好好谋划谋划,我没有连过这么长的。

我们也想过这个思路,但是载体上的位点在基因上有,所以不能切

发自小木虫Android客户端
9楼2015-12-01 16:30:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Demon黄

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by liling0601 at 2015-12-01 13:54:39
我的菌液PCR结果,这里有三个基因(每个挑8个单菌落)连在PGADT7上的,后面两个基因老连不上,割胶回收的浓度13左右,但是连接体系做了20微升,而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带

P51201-133853.jpg
...

应该是引物的特异性不高吧,所以才有杂带
10楼2015-12-01 16:37:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 liling0601 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +3 Tide man 2026-08-10 3/150 2026-08-10 21:48 by GZUZM
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +10 yufeiwaner 2026-08-09 11/550 2026-08-10 18:47 by yufeiwaner
[基金申请] 关于代码变化问题,想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 11/550 2026-08-10 17:09 by 六两废铜
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +14 Lanmanbaby 2026-08-09 22/1100 2026-08-10 14:57 by wwncly
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +4 布布和一二 2026-08-10 4/200 2026-08-10 14:50 by 医学老男孩
[基金申请] 8月时间戳变的,举个手。玩一下,释放压力 +11 archvillain 2026-08-04 13/650 2026-08-10 14:41 by seekfind
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode,很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 好消息?这个有何含义??? +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 纯娱乐,不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
信息提示
请填处理意见