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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建
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liling0601

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有3人参与

我通过高保真酶扩的两个4000+bp的序列，但是怎么都连接不到PGBKT7，或者Pcambia1301的载体上，麻烦有经验的各位给点建议，我用的是takara的T4连接酶，16度16小时或者24小时 4度过夜或者3天都连过，就是连不上，连上的菌液验证不出来，酶切多了个三千的条带或者是提出的质粒木有条带
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1楼 2015-11-30 11:10:03
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我只能说如果片段长了不好连接到载体上，可以在片段中部寻个酶切位点分开两段依次连接，我只是提供个思路，具体实验流程还要好好谋划谋划，我没有连过这么长的。
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没有做不到，只有想不到！
2楼2015-11-30 11:51:19
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Demon黄

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
就如楼上所说的，你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点，然后用相同酶将质粒载体酶切一下，然后再连（给目的片段加酶切位点时，关键是看质粒载体上有没有这两个酶的酶切位点）。
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3楼2015-11-30 18:40:52
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liling0601

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的，你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点，然后用相同酶将质粒载体酶切一下，然后再连（给目的片段加酶切位点时， ...

我的片段两端都加好酶切位点的，跟载体上一样的
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4楼2015-12-01 13:49:58
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liling0601

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的，你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点，然后用相同酶将质粒载体酶切一下，然后再连（给目的片段加酶切位点时， ...

我的菌液PCR结果，这里有三个基因（每个挑8个单菌落）连在PGADT7上的，后面两个基因老连不上，割胶回收的浓度13左右，但是连接体系做了20微升，而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带
载体构建
P51201-133853.jpg
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5楼2015-12-01 13:54:39
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liling0601

铜虫 (小有名气)
我的这两个基因目的条带666bp
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6楼2015-12-01 13:55:16
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Demon黄

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liling0601 at 2015-12-01 13:49:58
我的片段两端都加好酶切位点的，跟载体上一样的...

那一般都能连接的上的呀，连接酶应该是没问题的吧
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7楼2015-12-01 16:18:46
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liling0601

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-01 16:18:46
那一般都能连接的上的呀，连接酶应该是没问题的吧...

没有啊，新买的，takara的

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8楼2015-12-01 16:29:10
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liling0601

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-11-30 11:51:19
我只能说如果片段长了不好连接到载体上，可以在片段中部寻个酶切位点分开两段依次连接，我只是提供个思路，具体实验流程还要好好谋划谋划，我没有连过这么长的。

我们也想过这个思路，但是载体上的位点在基因上有，所以不能切

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9楼2015-12-01 16:30:39
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Demon黄

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liling0601 at 2015-12-01 13:54:39
我的菌液PCR结果，这里有三个基因（每个挑8个单菌落）连在PGADT7上的，后面两个基因老连不上，割胶回收的浓度13左右，但是连接体系做了20微升，而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带

P51201-133853.jpg
...

应该是引物的特异性不高吧，所以才有杂带
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10楼2015-12-01 16:37:18
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