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liling0601

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建已有3人参与

我通过高保真酶扩的两个4000+bp的序列,但是怎么都连接不到PGBKT7,或者Pcambia1301的载体上,麻烦有经验的各位给点建议,我用的是takara的T4连接酶,16度16小时或者24小时 4度过夜或者3天都连过,就是连不上,连上的菌液验证不出来,酶切多了个三千的条带或者是提出的质粒木有条带
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的,你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点,然后用相同酶将质粒载体酶切一下,然后再连(给目的片段加酶切位点时, ...

我的片段两端都加好酶切位点的,跟载体上一样的
4楼2015-12-01 13:49:58
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-11-30 18:40:52
就如楼上所说的,你得看你扩增的片段有没有和质粒载体上一样的酶切位点。一般粘端更好连接。或者你可以给你的目的片段3‘、5’端加上酶切位点,然后用相同酶将质粒载体酶切一下,然后再连(给目的片段加酶切位点时, ...

我的菌液PCR结果,这里有三个基因(每个挑8个单菌落)连在PGADT7上的,后面两个基因老连不上,割胶回收的浓度13左右,但是连接体系做了20微升,而且奇怪的是老有2000多淡淡的条带
载体构建
P51201-133853.jpg

5楼2015-12-01 13:54:39
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liling0601

铜虫 (小有名气)

我的这两个基因目的条带666bp
6楼2015-12-01 13:55:16
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-01 16:18:46
那一般都能连接的上的呀,连接酶应该是没问题的吧...

没有啊,新买的,takara的

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8楼2015-12-01 16:29:10
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-11-30 11:51:19
我只能说如果片段长了不好连接到载体上,可以在片段中部寻个酶切位点分开两段依次连接,我只是提供个思路,具体实验流程还要好好谋划谋划,我没有连过这么长的。

我们也想过这个思路,但是载体上的位点在基因上有,所以不能切

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9楼2015-12-01 16:30:39
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-01 16:37:18
应该是引物的特异性不高吧,所以才有杂带...

用的是载体上引物

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11楼2015-12-01 16:38:36
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-01 16:42:22
那我就不清楚了,那目的片段和质粒载体的添加比例是多少呀...

4:1和2:1都做过

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13楼2015-12-01 17:02:47
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by Demon黄 at 2015-12-02 18:39:47
因为我觉得你的质粒蛮大的,加大点目的片段的比例试试。。要是还不出来,你还是问下老师好了...

我老师也不知道怎么回事

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16楼2015-12-02 18:53:56
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liling0601

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by yjqhades at 2015-12-02 13:58:18
楼主,建议你试试天根生化的EasyGeno重组克隆系统,货号(VI201),该系统利用重组克隆原理,不需要再用双酶切连接,并且不用考虑酶切位点的问题,非常适合你现在的情况。

能扩这么长的么

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17楼2015-12-02 18:54:28
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