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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用植物cDNA扩增一个1700bp左右的全长序列，一直扩不出来，求助原因
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yangqian_517

新虫 (初入文坛)

[求助] 用植物cDNA扩增一个1700bp左右的全长序列，一直扩不出来，求助原因 已有4人参与

补充：1、引物是根据已有的cDNA序列设计的；2、同样的引物用基因组DNA做模板就能扩增出来；3、cDNA是反转录之后马上就做PCR的，同时还用荧光定量的引物扩增了一段200bp的小片段，200bp的片段能扩增出来，但是全长一直扩不出来。求助有经验的同学给分析一下
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1楼 2015-11-24 20:08:03
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匿名

用户注销 (正式写手)
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2楼2015-11-24 20:09:31
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东乐乐

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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yangqian_517: 金币+5, ★有帮助 2015-11-25 18:22:58
我之前一直也是扩不出来，这两天刚刚有点成绩。我问过生物公司的技术人员，也在论坛求助过，他们说可能是因为逆转录不完全，有一部分的链没有打开，你可以换个好一点的逆转录试剂盒，或者你可以试试用分段克隆的方法分别设计引物，克隆出几段，然后连接起来。有说用重叠延伸pcr方法连接几个片段的，但我用的是论坛求助时他们告诉我的方法，就是在你的目的序列里找到几个酶切位点，在酶切位点处设计引物，分别扩增出几个片段，酶切并胶回收后进行粘性末端连接，连完再以这个为模板，用全序列的引物进行pcr。

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3楼2015-11-24 21:28:39
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misang

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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yangqian_517: 金币+5, ★有帮助 2015-11-25 18:23:15
基因组DNA和cDNA不一样，你把退火温度降一下，你用的是扩增长片段的酶吗？

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4楼2015-11-25 13:16:12
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yangqian_517

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by misang at 2015-11-25 13:16:12
基因组DNA和cDNA不一样，你把退火温度降一下，你用的是扩增长片段的酶吗？

就是用普通的Taq酶做的，用DNA扩出来了，用cDNA就一直没有东西出来

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5楼2015-11-25 18:21:04
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misang

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by yangqian_517 at 2015-11-25 18:21:04
就是用普通的Taq酶做的，用DNA扩出来了，用cDNA就一直没有东西出来
...

DNA扩出来的不一定就是你要的片段，因为毕竟有内含子，除非你测过序了。我以前扩的时候，就1kb，怎么都扩不出，换了扩长片段的酶就扩出来了。如果你确定自己的RNA没降解的话，可以换个酶试试。

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6楼2015-11-25 18:36:14
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yangqian_517

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by misang at 2015-11-25 18:36:14
DNA扩出来的不一定就是你要的片段，因为毕竟有内含子，除非你测过序了。我以前扩的时候，就1kb，怎么都扩不出，换了扩长片段的酶就扩出来了。如果你确定自己的RNA没降解的话，可以换个酶试试。
...

RNA是最近才提的，测过OD，条带清晰，应该不会有降解，请问你是用什么酶扩的？谢谢～

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7楼2015-11-25 19:47:03
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misang

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by yangqian_517 at 2015-11-25 19:47:03
RNA是最近才提的，测过OD，条带清晰，应该不会有降解，请问你是用什么酶扩的？谢谢～
...

takara la taq，我用的是这个

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8楼2015-11-25 20:00:30
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飞儿05

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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3楼的建议不错。
还有就是你可以分几段PCR，然后用多段快速连接试剂盒直接把几段和载体连起来，省时省力。
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9楼2015-11-27 10:21:59
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gnot_nail

金虫 (正式写手)
我也在扩植物cDNA，两种材料 36个基因， 反正也是有的能扩出来有的不行，片段长度500-3000不等，有的换一种酶就能扩出来，反正就是多试试了，楼主有什么好的建议吗？
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10楼2015-12-29 09:37:07
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