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天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助 已有7人参与
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这两天做蓝白斑筛选，新手第一次做，今天观察平板时发现涂的10个板全部都是只长了白斑，一个蓝斑都没有看到？这是神马情况—————— 我先说下我做的过程，大神看看是不是哪里出了问题： 连接：切胶回收后我检测了回收的DNA后，开始做的转化，连接用的是takara公司的18T载体，按照说明做成10ul体系，连接了6小时，（我的目的片段在1000bp以下，说明书上写只需30分钟）。 转化：转化用的takara公司的DH5α感受态细胞50ul和10ul的连接产物，按照说明书进行转化操作，并加入500ul的soc培养基，混匀，37℃揺菌1小时。 涂板：我在每个板上涂了50mg/ml的IPTG20ul，20mg/ml的x-gal45ul（药品都是上周刚配的，x-gal也用锡箔纸包裹了），涂匀，盖上盖子，倒置超净台，关灯，放置一会儿。然后揺菌结束，菌液4000转，离心2-3min，弃上清，剩300ul左右菌液，平均涂到了2个处理过的平板上，封好后倒置与37℃恒温箱过夜培养。 下边这张图是培养了12小时左右拍的，10个板子全是只长白斑，一个蓝斑都没有。于是做了如下处理： 1.选2个板子37℃继续培养2小时，菌变大了，但是还是没有蓝色。 2.选8个放进了4℃冰箱，希望能抑制生长，另外看看能不能出现蓝斑，可是三四个小时后，还是没有出现蓝斑!!! 怎么破啊？大神们！看长出来的情况应该是我涂的菌液太多了，我操作过程有没有问题啊？什么情况导致了全白无蓝？蓝色显色很难吗？  IMG20151115101026.jpg |
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3楼2015-11-15 18:18:51
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你的意思是我直接挑白色单菌落，菌液pcr，有目的条带的，送去测序？我pcr出来的不是单一基因序列，用的通用引物，目的基因长度也不一张，之所以做克隆，就是为了尽可能筛选分离开这些不同序列。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-11-15 18:25:56
23楼2015-11-16 11:39:11
我今天随机挑了15个白斑，跑了菌液pcr，全部都有我的目的条带，又去问了一个老师，他说全部是白斑也是正常的，现在的载体转化效率高，看条带的情况，可以进行摇菌测序。第一次做蓝白斑，但愿是虚惊一场。愿接下来一切顺利，感谢各位的指导！！！ 发自小木虫Android客户端 |
30楼2015-11-16 16:39:23
gzbjzjchen
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wcq吴超群2楼2015-11-15 18:15:56
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6楼2015-11-15 18:55:35
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我刚才又跑实验室看了下放在4℃的板，已经放了快十个小时，还是没有蓝斑出现。听我同学说她有一次放了两天才有蓝斑。我明天上午再去看看。我又重新涂了两个新板，这次保证是涂干后封的。看下明天长得情况。如果还都是白斑，不管那么多了，我就先挑几个斑做下pcr看下有没有目的条带。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-11-15 21:15:34
gzbjzjchen
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10楼2015-11-15 21:48:33
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