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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

[求助] 天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助 已有7人参与

这两天做蓝白斑筛选，新手第一次做，今天观察平板时发现涂的10个板全部都是只长了白斑，一个蓝斑都没有看到？这是神马情况——————
      我先说下我做的过程，大神看看是不是哪里出了问题：
         连接：切胶回收后我检测了回收的DNA后，开始做的转化，连接用的是takara公司的18T载体，按照说明做成10ul体系，连接了6小时，（我的目的片段在1000bp以下，说明书上写只需30分钟）。
         转化：转化用的takara公司的DH5α感受态细胞50ul和10ul的连接产物，按照说明书进行转化操作，并加入500ul的soc培养基，混匀，37℃揺菌1小时。
        涂板：我在每个板上涂了50mg/ml的IPTG20ul，20mg/ml的x-gal45ul（药品都是上周刚配的，x-gal也用锡箔纸包裹了），涂匀，盖上盖子，倒置超净台，关灯，放置一会儿。然后揺菌结束，菌液4000转，离心2-3min，弃上清，剩300ul左右菌液，平均涂到了2个处理过的平板上，封好后倒置与37℃恒温箱过夜培养。

下边这张图是培养了12小时左右拍的，10个板子全是只长白斑，一个蓝斑都没有。于是做了如下处理：

1.选2个板子37℃继续培养2小时，菌变大了，但是还是没有蓝色。
2.选8个放进了4℃冰箱，希望能抑制生长，另外看看能不能出现蓝斑，可是三四个小时后，还是没有出现蓝斑!!!


怎么破啊？大神们！看长出来的情况应该是我涂的菌液太多了，我操作过程有没有问题啊？什么情况导致了全白无蓝？蓝色显色很难吗？

天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助
IMG20151115101026.jpg
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1楼 2015-11-15 18:12:03
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 218854055 at 2015-11-15 18:55:35
我用pGEM T EASY做TA克隆也是这样情况，用T7/SP6通用引物做菌落PCR全是假阳性，跑胶出现两条带，测序全部是载体。改了体系，换了药物和载体，还是那样，不知道为什么？

我刚才又跑实验室看了下放在4℃的板，已经放了快十个小时，还是没有蓝斑出现。听我同学说她有一次放了两天才有蓝斑。我明天上午再去看看。我又重新涂了两个新板，这次保证是涂干后封的。看下明天长得情况。如果还都是白斑，不管那么多了，我就先挑几个斑做下pcr看下有没有目的条带。

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7楼2015-11-15 21:15:34
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gzbjzjchen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
因为转化效率高，随便挑那个菌都可以用

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wcq吴超群
2楼2015-11-15 18:15:56
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)
是吗？这种几率也太小了吧，哈哈哈，我不敢相信

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3楼2015-11-15 18:18:51
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gzbjzjchen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wcq吴超群 at 2015-11-15 18:18:51
是吗？这种几率也太小了吧，哈哈哈，我不敢相信

现在都不用蓝白筛选法了，直接往下做，你可以测序

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4楼2015-11-15 18:21:09
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