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gzbjzjchen

铜虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by wcq吴超群 at 2015-11-15 21:42:07
嗯,不是单一的片段。有很多片段,500-750bp之间的。基本要构建库
...

你酶切位点没有吗?

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11楼2015-11-15 21:49:12
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方林然

新虫 (小有名气)

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6楼: Originally posted by 218854055 at 2015-11-15 18:55:35
我用pGEM T EASY做TA克隆也是这样情况,用T7/SP6通用引物做菌落PCR全是假阳性,跑胶出现两条带,测序全部是载体。改了体系,换了药物和载体,还是那样,不知道为什么?

有人说takara的T载体其实不能做蓝白斑,用promega的吧

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12楼2015-11-15 22:03:36
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

是这样,我的dna模板是用真菌通用引物引的植物内生真菌的所有片段,其实没有特殊的目的性,所以切胶回收的是500-750bp之间的所有片段,回收到了一起。然后想通过蓝白斑筛选的办法把这些片段尽可能的分开,然后用菌液测序,再去数据库比对序列,大致确定真菌菌种。我也是看一些博士论文这么做的,自己也没做过这些实验。
13楼2015-11-15 22:18:34
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

14楼2015-11-15 23:18:58
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sugeng2000

新虫 (正式写手)

引用回帖:
1楼: Originally posted by wcq吴超群 at 2015-11-15 18:12:03
这两天做蓝白斑筛选,新手第一次做,今天观察平板时发现涂的10个板全部都是只长了白斑,一个蓝斑都没有看到?这是神马情况——————
      我先说下我做的过程,大神看看是不是哪里出了问题:
         连接: ...

我最开始涂板也遇到这种情况,后来证明我筛选药物配的不对,我是用氨卞筛选。你可以将筛选浓度提高,就是到平板时,多加点筛选的药试试,要是还不行就重配吧。你的菌落长的挺好的,都是单一菌落,你可以挑几个送测序,看看。祝实验早日成功。

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15楼2015-11-16 00:19:56
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jackyoung

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
宝生物的这个载体如果有那么高的成功率真是神了……蓝白斑的问题本不是问题,因为即使是白班也只是有理论上的插入,并非一定就是对的。以本人粗浅的经验,pMD18-T这个载体连500bp以下的效果还不错,再大点就呵呵了,那个效率啊…
还有,你那IPTG那么高是什么鬼?我们可用不了那么多,你为毛加那么多?蓝白斑不成,八成是X-gal的问题,你得确认别人拿你的做成功过。同时,提醒一句,我遇到过一个公司的死活不行的情况(原因很多,比如说过期了,但分装的不告诉我们),换一个公司试试就好了。

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CestLaVie
16楼2015-11-16 00:32:04
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张正禹

新虫 (小有名气)

菌浓度太高了,涂板的时候,我们实验室都没有离心,取160微升直接涂板

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17楼2015-11-16 00:34:53
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jackyoung

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有,你只提到了平板,没有说抗生素抗性,请确认抗性是否对?抗生素浓度是否合适?不会过期或失效吧?如果没有抗性长个满板都是没有转化的没有蓝斑也很正常。

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CestLaVie
18楼2015-11-16 00:35:30
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
19楼2015-11-16 01:32:46
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by sugeng2000 at 2015-11-16 00:19:56
我最开始涂板也遇到这种情况,后来证明我筛选药物配的不对,我是用氨卞筛选。你可以将筛选浓度提高,就是到平板时,多加点筛选的药试试,要是还不行就重配吧。你的菌落长的挺好的,都是单一菌落,你可以挑几个送测 ...

我用的也是氨苄,100mg/ML,100ML的lb固体培养基加了100ul,……可能加氨苄倒板时温度高了

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20楼2015-11-16 08:33:06
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