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天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助 已有7人参与
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这两天做蓝白斑筛选，新手第一次做，今天观察平板时发现涂的10个板全部都是只长了白斑，一个蓝斑都没有看到？这是神马情况—————— 我先说下我做的过程，大神看看是不是哪里出了问题： 连接：切胶回收后我检测了回收的DNA后，开始做的转化，连接用的是takara公司的18T载体，按照说明做成10ul体系，连接了6小时，（我的目的片段在1000bp以下，说明书上写只需30分钟）。 转化：转化用的takara公司的DH5α感受态细胞50ul和10ul的连接产物，按照说明书进行转化操作，并加入500ul的soc培养基，混匀，37℃揺菌1小时。 涂板：我在每个板上涂了50mg/ml的IPTG20ul，20mg/ml的x-gal45ul（药品都是上周刚配的，x-gal也用锡箔纸包裹了），涂匀，盖上盖子，倒置超净台，关灯，放置一会儿。然后揺菌结束，菌液4000转，离心2-3min，弃上清，剩300ul左右菌液，平均涂到了2个处理过的平板上，封好后倒置与37℃恒温箱过夜培养。 下边这张图是培养了12小时左右拍的，10个板子全是只长白斑，一个蓝斑都没有。于是做了如下处理： 1.选2个板子37℃继续培养2小时，菌变大了，但是还是没有蓝色。 2.选8个放进了4℃冰箱，希望能抑制生长，另外看看能不能出现蓝斑，可是三四个小时后，还是没有出现蓝斑!!! 怎么破啊？大神们！看长出来的情况应该是我涂的菌液太多了，我操作过程有没有问题啊？什么情况导致了全白无蓝？蓝色显色很难吗？  IMG20151115101026.jpg |
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jackyoung
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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宝生物的这个载体如果有那么高的成功率真是神了……蓝白斑的问题本不是问题，因为即使是白班也只是有理论上的插入，并非一定就是对的。以本人粗浅的经验，pMD18-T这个载体连500bp以下的效果还不错，再大点就呵呵了，那个效率啊… 还有，你那IPTG那么高是什么鬼？我们可用不了那么多，你为毛加那么多？蓝白斑不成，八成是X-gal的问题，你得确认别人拿你的做成功过。同时，提醒一句，我遇到过一个公司的死活不行的情况（原因很多，比如说过期了，但分装的不告诉我们），换一个公司试试就好了。 发自小木虫Android客户端 |
16楼2015-11-16 00:32:04
gzbjzjchen
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wcq吴超群2楼2015-11-15 18:15:56
3楼2015-11-15 18:18:51
gzbjzjchen
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4楼2015-11-15 18:21:09
20