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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

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[求助] 天啊，长得全是白斑，没有蓝斑？蓝白斑筛选问题求助已有7人参与

这两天做蓝白斑筛选，新手第一次做，今天观察平板时发现涂的10个板全部都是只长了白斑，一个蓝斑都没有看到？这是神马情况——————
   我先说下我做的过程，大神看看是不是哪里出了问题：
      连接：切胶回收后我检测了回收的DNA后，开始做的转化，连接用的是takara公司的18T载体，按照说明做成10ul体系，连接了6小时，（我的目的片段在1000bp以下，说明书上写只需30分钟）。
      转化：转化用的takara公司的DH5α感受态细胞50ul和10ul的连接产物，按照说明书进行转化操作，并加入500ul的soc培养基，混匀，37℃揺菌1小时。
      涂板：我在每个板上涂了50mg/ml的IPTG20ul，20mg/ml的x-gal45ul（药品都是上周刚配的，x-gal也用锡箔纸包裹了），涂匀，盖上盖子，倒置超净台，关灯，放置一会儿。然后揺菌结束，菌液4000转，离心2-3min，弃上清，剩300ul左右菌液，平均涂到了2个处理过的平板上，封好后倒置与37℃恒温箱过夜培养。

下边这张图是培养了12小时左右拍的，10个板子全是只长白斑，一个蓝斑都没有。于是做了如下处理：

1.选2个板子37℃继续培养2小时，菌变大了，但是还是没有蓝色。
2.选8个放进了4℃冰箱，希望能抑制生长，另外看看能不能出现蓝斑，可是三四个小时后，还是没有出现蓝斑!!!

怎么破啊？大神们！看长出来的情况应该是我涂的菌液太多了，我操作过程有没有问题啊？什么情况导致了全白无蓝？蓝色显色很难吗？

IMG20151115101026.jpg

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1楼 2015-11-15 18:12:03

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jackyoung

新虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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宝生物的这个载体如果有那么高的成功率真是神了……蓝白斑的问题本不是问题，因为即使是白班也只是有理论上的插入，并非一定就是对的。以本人粗浅的经验，pMD18-T这个载体连500bp以下的效果还不错，再大点就呵呵了，那个效率啊…
还有，你那IPTG那么高是什么鬼？我们可用不了那么多，你为毛加那么多？蓝白斑不成，八成是X-gal的问题，你得确认别人拿你的做成功过。同时，提醒一句，我遇到过一个公司的死活不行的情况（原因很多，比如说过期了，但分装的不告诉我们），换一个公司试试就好了。

发自小木虫Android客户端