应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释
131/2返回列表12下一页
查看: 2220  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

策马入林

新虫 (小有名气)

[交流] 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释

测定原核表达，镍柱纯化得到的一个NADPH依赖的还原酶，在测定这个酶的活性的时候发现一个问题：
体系1：正常的反应体系，加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0正常反应
体系2：对照组，加入煮死的酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0
体系3：加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0，这一体系里不加底物
在333nm下测定反应30min的情况，结果很让人费解：
我们发现，正常反应体系反应催化底物减少的ABS值没有没加底物的体系3降低得多，换句话说，即使不加底物，单纯的酶与NADPH也可以一直反应并出现
ABS的持续下降？？
自己排查了一些因素于是做了一些对照试验：1，体系2中煮死的酶的情况下是没有这一现象的，虽然消光系数有上下波动，但是是在可以接受的范围内。
                                                                       2， 换用本实验室同种方法纯化的另一个酶（这个酶是裂解酶，没有还原活性，也不是NADPH依赖的），配置
                                                                              体系3，测定结果和对照组类似（体系2的结果，也即是煮死酶的情况）
这样看来似乎可以排除是体系中其他溶液的问题，或者蛋白纯化过程引进的物质的影响，可是对于这一还原酶体系3里的情况该怎么解释，难道可以单纯的催化NADPH？
求各位前辈各位大侠指教，谢谢啦
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-11-15 17:01:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 策马入林 at 2015-11-16 11:03:57
你好，我用的缓冲体系是PH6.0的磷酸盐缓冲液，是可能提供H，我刚才查了一下NADPH循环体系，对于酶学方法的再生体系，一般是需要两个酶藕联反应，而且应该还是需要一个酶催化的底物吧，可是我没有加底物，NADPH 也发 ...

呃，我理解错了，溶剂应该不会参与反应，我觉得可能是NADPH不稳定导致，你觉得有这种可能吗？
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2015-11-16 11:18:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

扶正2013

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
几点建议
1 测定NADPH的减少用的波长一般为340nm，建议按这个波长试一下
2 吸光值的降低不一定反应真实的酶反应速率，请考虑在pH 6的情况下NADPH是否存在自发降解，尝试用其他pH值
3 纯化的酶可能与底物共纯化，没加外源底物也可以进行催化，外源底物浓度过高，可鞥存在底物抑制，尝试用不同的底物浓度试一下
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2015-12-11 22:49:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

策马入林

新虫 (小有名气)
在线等等，好焦急
回复此楼
2楼2015-11-15 17:03:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

策马入林

新虫 (小有名气)
看来只有自己再顶一下了
赞一下 回复此楼
3楼2015-11-15 17:16:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
NADPH与溶剂，酶构建NADPH循环体系了吧？溶剂有可能是供氢体
赞一下 回复此楼
4楼2015-11-16 09:17:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

策马入林

新虫 (小有名气)
你好，我用的缓冲体系是PH6.0的磷酸盐缓冲液，是可能提供H，我刚才查了一下NADPH循环体系，对于酶学方法的再生体系，一般是需要两个酶藕联反应，而且应该还是需要一个酶催化的底物吧，可是我没有加底物，NADPH 也发生了反应，是不是我有一些地方没有理解，还请详细解释一下，不胜感激
赞一下 回复此楼
5楼2015-11-16 11:03:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by CZ.HUANG at 2015-11-16 11:18:45
呃，我理解错了，溶剂应该不会参与反应，我觉得可能是NADPH不稳定导致，你觉得有这种可能吗？...

我也是怀疑过，所以有一个煮死酶的对照，如果是NADPH不稳定应该也会出现类似的下降，事实上没有。。。。
赞一下 回复此楼
7楼2015-11-16 11:54:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
策马入林: 金币+2, 多谢一直以来的交流学习 2015-11-16 16:40:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by 策马入林 at 2015-11-16 11:54:55
我也是怀疑过，所以有一个煮死酶的对照，如果是NADPH不稳定应该也会出现类似的下降，事实上没有。。。。...

溶液是否澄清，油水是否乳化，静止状态，OD会变化
如果你这边验证体系无影响，那回到刚才的猜想：有的溶剂也会与酶反应，做为底物。
辅酶NADPH循环再生也是酶催化反应，正常酶催化反应，是两个酶偶联，但是这两个体系可以看作是独立的两个酶催化反应，所以没有你说的目标产物的底物，并不代表没有酶能够催化的底物，
我很好奇这个酶哦，还是有可能是将溶剂作为底物了
赞一下 回复此楼
8楼2015-11-16 13:49:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by CZ.HUANG at 2015-11-16 13:49:51
溶液是否澄清，油水是否乳化，静止状态，OD会变化
如果你这边验证体系无影响，那回到刚才的猜想：有的溶剂也会与酶反应，做为底物。
辅酶NADPH循环再生也是酶催化反应，正常酶催化反应，是两个酶偶联，但是这两个 ...

我现在也很好奇啊，溶液是澄清的，这个反应体系也是多篇文献报道的，不知道他们测定的时候有没有发现这个现象，现在我是很蛋疼。现在我在准备用液相来检测一下究竟有没有产物。
今天实验室和小老板讨论了下，也没什么结果，先等液相结果吧
赞一下 回复此楼
9楼2015-11-16 16:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 策马入林 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 GpvwGNVshCOp 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:39 by thgx1vqMqrLw
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 yPv6ndDtiRxQ 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:15 by CLKTSgjM0Uqj
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +3 工厂打螺丝 2026-08-08 3/150 2026-08-11 13:42 by 会议编辑
[基金申请] FileCode能看出啥？ +7 要乐观耀哥 2026-08-10 17/850 2026-08-11 10:50 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +10 yufeiwaner 2026-08-09 11/550 2026-08-10 18:47 by yufeiwaner
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭