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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释
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策马入林

新虫 (小有名气)

[交流] 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释

测定原核表达，镍柱纯化得到的一个NADPH依赖的还原酶，在测定这个酶的活性的时候发现一个问题：
体系1：正常的反应体系，加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0正常反应
体系2：对照组，加入煮死的酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0
体系3：加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0，这一体系里不加底物
在333nm下测定反应30min的情况，结果很让人费解：
我们发现，正常反应体系反应催化底物减少的ABS值没有没加底物的体系3降低得多，换句话说，即使不加底物，单纯的酶与NADPH也可以一直反应并出现
ABS的持续下降？？
自己排查了一些因素于是做了一些对照试验：1，体系2中煮死的酶的情况下是没有这一现象的，虽然消光系数有上下波动，但是是在可以接受的范围内。
                                                                       2， 换用本实验室同种方法纯化的另一个酶（这个酶是裂解酶，没有还原活性，也不是NADPH依赖的），配置
                                                                              体系3，测定结果和对照组类似（体系2的结果，也即是煮死酶的情况）
这样看来似乎可以排除是体系中其他溶液的问题，或者蛋白纯化过程引进的物质的影响，可是对于这一还原酶体系3里的情况该怎么解释，难道可以单纯的催化NADPH？
求各位前辈各位大侠指教，谢谢啦
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1楼 2015-11-15 17:01:13
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CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 策马入林 at 2015-11-16 11:03:57
你好，我用的缓冲体系是PH6.0的磷酸盐缓冲液，是可能提供H，我刚才查了一下NADPH循环体系，对于酶学方法的再生体系，一般是需要两个酶藕联反应，而且应该还是需要一个酶催化的底物吧，可是我没有加底物，NADPH 也发 ...

呃，我理解错了，溶剂应该不会参与反应，我觉得可能是NADPH不稳定导致，你觉得有这种可能吗？
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6楼2015-11-16 11:18:45
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扶正2013

新虫 (小有名气)
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几点建议
1 测定NADPH的减少用的波长一般为340nm，建议按这个波长试一下
2 吸光值的降低不一定反应真实的酶反应速率，请考虑在pH 6的情况下NADPH是否存在自发降解，尝试用其他pH值
3 纯化的酶可能与底物共纯化，没加外源底物也可以进行催化，外源底物浓度过高，可鞥存在底物抑制，尝试用不同的底物浓度试一下
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10楼2015-12-11 22:49:16
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策马入林

新虫 (小有名气)
在线等等，好焦急
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2楼2015-11-15 17:03:17
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策马入林

新虫 (小有名气)
看来只有自己再顶一下了
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3楼2015-11-15 17:16:56
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CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
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NADPH与溶剂，酶构建NADPH循环体系了吧？溶剂有可能是供氢体
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4楼2015-11-16 09:17:40
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策马入林

新虫 (小有名气)
你好，我用的缓冲体系是PH6.0的磷酸盐缓冲液，是可能提供H，我刚才查了一下NADPH循环体系，对于酶学方法的再生体系，一般是需要两个酶藕联反应，而且应该还是需要一个酶催化的底物吧，可是我没有加底物，NADPH 也发生了反应，是不是我有一些地方没有理解，还请详细解释一下，不胜感激
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5楼2015-11-16 11:03:57
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策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by CZ.HUANG at 2015-11-16 11:18:45
呃，我理解错了，溶剂应该不会参与反应，我觉得可能是NADPH不稳定导致，你觉得有这种可能吗？...

我也是怀疑过，所以有一个煮死酶的对照，如果是NADPH不稳定应该也会出现类似的下降，事实上没有。。。。
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7楼2015-11-16 11:54:55
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CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
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策马入林: 金币+2, 多谢一直以来的交流学习 2015-11-16 16:40:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by 策马入林 at 2015-11-16 11:54:55
我也是怀疑过，所以有一个煮死酶的对照，如果是NADPH不稳定应该也会出现类似的下降，事实上没有。。。。...

溶液是否澄清，油水是否乳化，静止状态，OD会变化
如果你这边验证体系无影响，那回到刚才的猜想：有的溶剂也会与酶反应，做为底物。
辅酶NADPH循环再生也是酶催化反应，正常酶催化反应，是两个酶偶联，但是这两个体系可以看作是独立的两个酶催化反应，所以没有你说的目标产物的底物，并不代表没有酶能够催化的底物，
我很好奇这个酶哦，还是有可能是将溶剂作为底物了
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8楼2015-11-16 13:49:51
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策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by CZ.HUANG at 2015-11-16 13:49:51
溶液是否澄清，油水是否乳化，静止状态，OD会变化
如果你这边验证体系无影响，那回到刚才的猜想：有的溶剂也会与酶反应，做为底物。
辅酶NADPH循环再生也是酶催化反应，正常酶催化反应，是两个酶偶联，但是这两个 ...

我现在也很好奇啊，溶液是澄清的，这个反应体系也是多篇文献报道的，不知道他们测定的时候有没有发现这个现象，现在我是很蛋疼。现在我在准备用液相来检测一下究竟有没有产物。
今天实验室和小老板讨论了下，也没什么结果，先等液相结果吧
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9楼2015-11-16 16:40:04
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