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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释
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策马入林

新虫 (小有名气)

[交流] 测定NADPH依赖的酶活性的诡异现象，求解释

测定原核表达，镍柱纯化得到的一个NADPH依赖的还原酶，在测定这个酶的活性的时候发现一个问题：
体系1：正常的反应体系，加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0正常反应
体系2：对照组，加入煮死的酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0
体系3：加入了酶，NADPH，底物，缓冲体系PH=6.0，这一体系里不加底物
在333nm下测定反应30min的情况，结果很让人费解：
我们发现，正常反应体系反应催化底物减少的ABS值没有没加底物的体系3降低得多，换句话说，即使不加底物，单纯的酶与NADPH也可以一直反应并出现
ABS的持续下降？？
自己排查了一些因素于是做了一些对照试验：1，体系2中煮死的酶的情况下是没有这一现象的，虽然消光系数有上下波动，但是是在可以接受的范围内。
                                                                       2， 换用本实验室同种方法纯化的另一个酶（这个酶是裂解酶，没有还原活性，也不是NADPH依赖的），配置
                                                                              体系3，测定结果和对照组类似（体系2的结果，也即是煮死酶的情况）
这样看来似乎可以排除是体系中其他溶液的问题，或者蛋白纯化过程引进的物质的影响，可是对于这一还原酶体系3里的情况该怎么解释，难道可以单纯的催化NADPH？
求各位前辈各位大侠指教，谢谢啦
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1楼 2015-11-15 17:01:13
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CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
策马入林: 金币+2, 多谢一直以来的交流学习 2015-11-16 16:40:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by 策马入林 at 2015-11-16 11:54:55
我也是怀疑过，所以有一个煮死酶的对照，如果是NADPH不稳定应该也会出现类似的下降，事实上没有。。。。...

溶液是否澄清，油水是否乳化，静止状态，OD会变化
如果你这边验证体系无影响，那回到刚才的猜想：有的溶剂也会与酶反应，做为底物。
辅酶NADPH循环再生也是酶催化反应，正常酶催化反应，是两个酶偶联，但是这两个体系可以看作是独立的两个酶催化反应，所以没有你说的目标产物的底物，并不代表没有酶能够催化的底物，
我很好奇这个酶哦，还是有可能是将溶剂作为底物了
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8楼2015-11-16 13:49:51
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策马入林

新虫 (小有名气)
在线等等，好焦急
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2楼2015-11-15 17:03:17
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策马入林

新虫 (小有名气)
看来只有自己再顶一下了
赞一下 回复此楼
3楼2015-11-15 17:16:56
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CZ.HUANG

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
NADPH与溶剂，酶构建NADPH循环体系了吧？溶剂有可能是供氢体
赞一下 回复此楼
4楼2015-11-16 09:17:40
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