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关于酵母表达真菌蛋白的一些困惑！ 已有1人参与
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各位大神好！本人最近在用ppic9k酵母表达载体表达一个真菌里面的蛋白。测序结果已经显示我想要的蛋白序列已经成功连入了载体上，用MD平板也筛选到了his+的转化子，但是进行诱导后用镍柱纯化蛋白却没有得到我的目的蛋白，看来是没有成功表达！很是烦恼！现在怀疑是不是9k载体上面的AOX1启动子被破坏了，所以设计了引物去测序，但是结果还没有出来！很着急！然后看了篇文献上面写到作者在表达蛋白的时候去除了内含子以及信号肽序列，我之前表达的时候先去ncbi找到目的蛋白的cds序列，然后去除了信号肽，提RNA后扩增出不包含信号肽的目的序列。然后进行后续操作。请问各位大神，是不是由于没有考虑去除内含子的原因，所以我的目的蛋白才没有表达出来？跪谢！！ 发自小木虫IOS客户端 |
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shengliding
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8楼2015-11-15 00:01:50
2楼2015-11-13 17:32:17
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3楼2015-11-13 18:06:47
4楼2015-11-13 18:52:36
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谢谢谢谢！我按照诱导手册来诱导的，也诱导了两遍，都没成功。还有就是，请为你知道如何去除内含子吗？因为我就直接从ncbi上面找到了该蛋白的cds编码区，里面也没有说明哪些是内含子，不知道有没有什么工具或者方法可以去除内含子？ 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2015-11-13 18:57:52
lwk5716
铁杆木虫 (正式写手)
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7楼2015-11-14 21:06:42
9楼2015-11-16 09:21:16
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在ncbi里面我选的cds区域，就是编码区。根据这个克隆然后表达。用的9K质粒。但是转化到酵母gs115里面之后提取酵母组基因，照理说用AOX1通用引物应该有两条条带，但是只有一条。难道gs115里面的AOX1基因组坏了？还有就是我诱导的时候发酵液好臭，难道染菌了？可以通过加抗生素amp之类的诱导吗？做WB也没有，看来是没表达出来，但是测序结果都显示正确！不知道为啥，难道要重新做吗？ 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2015-11-16 12:15:27