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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于酵母表达真菌蛋白的一些困惑！
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)

[交流] 关于酵母表达真菌蛋白的一些困惑！ 已有1人参与

各位大神好！本人最近在用ppic9k酵母表达载体表达一个真菌里面的蛋白。测序结果已经显示我想要的蛋白序列已经成功连入了载体上，用MD平板也筛选到了his+的转化子，但是进行诱导后用镍柱纯化蛋白却没有得到我的目的蛋白，看来是没有成功表达！很是烦恼！现在怀疑是不是9k载体上面的AOX1启动子被破坏了，所以设计了引物去测序，但是结果还没有出来！很着急！然后看了篇文献上面写到作者在表达蛋白的时候去除了内含子以及信号肽序列，我之前表达的时候先去ncbi找到目的蛋白的cds序列，然后去除了信号肽，提RNA后扩增出不包含信号肽的目的序列。然后进行后续操作。请问各位大神，是不是由于没有考虑去除内含子的原因，所以我的目的蛋白才没有表达出来？跪谢！！

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1楼 2015-11-13 17:32:01
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
肉肉肉.: 金币+5, 谢谢谢谢 2015-11-16 12:16:45
楼主先查一下这个基因的基因组序列，可能你的基因里面根本没有内含子，比如酿酒酵母基因组中只有4%的编码基因含有小的内含子。如果有一般酵母蛋白表达都是用RT-PCR或overlap PCR等方法去除内含子获得cDNA，然后再做相应的表达。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
9楼2015-11-16 09:21:16
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
救命啊！

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2楼2015-11-13 17:32:17
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fMssop

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
肉肉肉.: 金币+10 2015-11-13 18:55:16
我感觉更像是诱导环节出现问题，就是说不是载体的问题，而是就没表达出想要的蛋白质。关于酵母诱导方式，最好在查询相关文献。其次就是跨物种表达蛋白质，应该是都要求去掉内含子的，毕竟不同物种内含子的剪切方式不同，就算是成功表达也不一定就是所需要的蛋白质。
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4楼2015-11-13 18:52:36
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fMssop at 2015-11-13 18:52:36
我感觉更像是诱导环节出现问题，就是说不是载体的问题，而是就没表达出想要的蛋白质。关于酵母诱导方式，最好在查询相关文献。其次就是跨物种表达蛋白质，应该是都要求去掉内含子的，毕竟不同物种内含子的剪切方式不 ...

谢谢谢谢！我按照诱导手册来诱导的，也诱导了两遍，都没成功。还有就是，请为你知道如何去除内含子吗？因为我就直接从ncbi上面找到了该蛋白的cds编码区，里面也没有说明哪些是内含子，不知道有没有什么工具或者方法可以去除内含子？

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5楼2015-11-13 18:57:52
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