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【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 gaofei047290 的 10 个金币

gaofei047290

[交流] PCR产物为什么切不开

我做的是PCR-RFLP法分析SNP:
引物是参照文献设计,takara合成的。
订购的是takara的Taq酶。
PCR 条件也是文献中的,1%琼脂糖电泳显示PCR产物大小为290bp。
用文献报道的Msp I 1μL,PCR产物10μL,酶切4小时(16小时也切过),3%琼脂糖电泳显示产物为310bp左右。
切开的片段应该为168bp和122bp。
为什么酶切产物变大了?为什么PCR产物没有被切开呢?
试了很多次都不行,也换过很多模板,但都是这种情况,takara书上说可能是蛋白质的影响,但是酶切产物电泳同时使用了内切酶提供的10×buffer还是这种情况,是在是困惑!谢谢大家
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)

上图看看。我实验室有一例类似情况,属于引物合成错误,也可测序看看。
2楼2008-09-13 00:18:08
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)

首先,假定你的PCR没有问题。MspI 不是很常用的酶,所以酶切效率会很低,最好是把PCR产物纯化一下再酶切。另外,建议加个酶切前的做个对照。好运。
引用回帖:
Originally posted by gaofei047290 at 2008-9-12 22:10:
我做的是PCR-RFLP法分析SNP:
引物是参照文献设计,takara合成的。
订购的是takara的Taq酶。
PCR 条件也是文献中的,1%琼脂糖电泳显示PCR产物大小为290bp。
用文献报道的Msp I 1μL,PCR产物10μL,酶切4小时( ...

3楼2008-09-13 02:21:09
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gaofei047290

谢谢回帖的虫友!
PCR产物怎么纯化呢?可否加大内切酶的用量?
酶切前的pcr产物做过对照,酶切后产物明显比PCR产物变大。
takara合成的引物质量可以吗?
请介绍一家合成引物较好的公司。谢谢
4楼2008-09-13 20:31:45
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rainfinder

银虫 (著名写手)

1. 琼脂糖电泳胶浓度不一样,出现一些大小差别,应属正常,最好在同一块胶上比大小。
2. 非特异性产物的可能性也有,测序看看吧。另外会不会碱基变化改变了酶切位点
5楼2008-09-13 20:52:15
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gaofei047290

各位虫友中秋快乐!
就是在同一块胶上跑的
PCR产物和预期大小一样应该能排除引物的问题了吧
另外PCR产物怎么纯化呢?
其他位点酶切的时候也不用作PCR产物纯化就能切开啊!
6楼2008-09-14 00:47:57
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yat

金虫 (小有名气)

如果PCR条带单一,我们一般用BBI的PCR纯化试剂盒
如果PCR产物有杂带,就用采用胶回收的办法纯化.
做最好的自己,永不放弃!
7楼2008-09-14 21:18:39
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gaofei047290

大量的pcr产物纯化现不现实啊?
请教
8楼2008-09-15 23:22:14
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ningluztt

铜虫 (小有名气)

可以,
1.有杂带的话用胶回收,有一种梳子梳孔很大,就是专门用于大量DNA胶回收的
2.没有杂带的话尝试用1/10体积的醋酸钠,3体积的无水乙醇进行纯化,再进行酶切,但这种方法要注意不要把DNA 弄丢了
9楼2008-09-16 09:58:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

PCR产物不纯化直接酶切是很恶心的
想想看里头都有些什么组分……残留的Taq、Mg2+、dNTP等
你说在酶促反应体系里头有这些东西切完会发生什么事情……
10楼2008-09-16 10:47:20
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