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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR产物为什么切不开
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 gaofei047290 的 10 个金币

gaofei047290

[交流] PCR产物为什么切不开

我做的是PCR-RFLP法分析SNP：
引物是参照文献设计，takara合成的。
订购的是takara的Taq酶。
PCR 条件也是文献中的，1%琼脂糖电泳显示PCR产物大小为290bp。
用文献报道的Msp I 1μL，PCR产物10μL,酶切4小时（16小时也切过），3%琼脂糖电泳显示产物为310bp左右。
切开的片段应该为168bp和122bp。
为什么酶切产物变大了？为什么PCR产物没有被切开呢？
试了很多次都不行，也换过很多模板，但都是这种情况，takara书上说可能是蛋白质的影响，但是酶切产物电泳同时使用了内切酶提供的10×buffer还是这种情况,是在是困惑！谢谢大家
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1楼 2008-09-12 22:10:36
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
上图看看。我实验室有一例类似情况，属于引物合成错误，也可测序看看。
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2楼2008-09-13 00:18:08
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)
首先，假定你的PCR没有问题。MspI 不是很常用的酶，所以酶切效率会很低，最好是把PCR产物纯化一下再酶切。另外，建议加个酶切前的做个对照。好运。
引用回帖:
Originally posted by gaofei047290 at 2008-9-12 22:10:
我做的是PCR-RFLP法分析SNP：
引物是参照文献设计，takara合成的。
订购的是takara的Taq酶。
PCR 条件也是文献中的，1%琼脂糖电泳显示PCR产物大小为290bp。
用文献报道的Msp I 1μL，PCR产物10μL,酶切4小时（ ...

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3楼2008-09-13 02:21:09
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gaofei047290

谢谢回帖的虫友！
PCR产物怎么纯化呢？可否加大内切酶的用量？
酶切前的pcr产物做过对照，酶切后产物明显比PCR产物变大。
takara合成的引物质量可以吗？
请介绍一家合成引物较好的公司。谢谢
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4楼2008-09-13 20:31:45
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rainfinder

银虫 (著名写手)
1. 琼脂糖电泳胶浓度不一样，出现一些大小差别，应属正常，最好在同一块胶上比大小。
2. 非特异性产物的可能性也有，测序看看吧。另外会不会碱基变化改变了酶切位点
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5楼2008-09-13 20:52:15
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gaofei047290

各位虫友中秋快乐！
就是在同一块胶上跑的
PCR产物和预期大小一样应该能排除引物的问题了吧
另外PCR产物怎么纯化呢？
其他位点酶切的时候也不用作PCR产物纯化就能切开啊！
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6楼2008-09-14 00:47:57
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yat

金虫 (小有名气)
如果PCR条带单一,我们一般用BBI的PCR纯化试剂盒
如果PCR产物有杂带,就用采用胶回收的办法纯化.
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做最好的自己，永不放弃！
7楼2008-09-14 21:18:39
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gaofei047290

大量的pcr产物纯化现不现实啊？
请教
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8楼2008-09-15 23:22:14
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
可以，
1.有杂带的话用胶回收，有一种梳子梳孔很大，就是专门用于大量DNA胶回收的
2.没有杂带的话尝试用1/10体积的醋酸钠，3体积的无水乙醇进行纯化，再进行酶切，但这种方法要注意不要把DNA 弄丢了
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9楼2008-09-16 09:58:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
PCR产物不纯化直接酶切是很恶心的
想想看里头都有些什么组分……残留的Taq、Mg2+、dNTP等
你说在酶促反应体系里头有这些东西切完会发生什么事情……
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10楼2008-09-16 10:47:20
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