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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆 已有6人参与

本人正在做基因克隆，但是第一步做pcr，发现pcr产物是多带，不明白原因，求各位大牛帮忙！

基因克隆


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1楼 2015-10-31 20:11:43
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yvonne9044

新虫 (正式写手)

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★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:25
引物的问题吧，能回收留着不用重新设计，不然再看看引物吧，还有你的退火温度，也很重要！

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6楼2015-10-31 23:19:28
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宋天雪

新虫 (初入文坛)
可能是引物本身发生了自连，形成大小不一的引物二聚体，跑胶时才会出现许多杂带。

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7楼2015-10-31 23:37:38
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:33
多带就是有好多非特异性条带咯，应该是引物的问题。不过你切胶回收就好了啊，切好就行。
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2楼2015-10-31 20:22:53
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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-10-31 20:22:53
多带就是有好多非特异性条带咯，应该是引物的问题。不过你切胶回收就好了啊，切好就行。

就是因为非特异性条带太多了，所以才不好切和纯化，无法回收到目的片段，请问引物如何设计呢？

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3楼2015-10-31 20:31:41
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akane1020

金虫 (初入文坛)

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可以考虑以下几点：
1. 模板纯吗？
2.引物的binding
3. annealing temperature 是不是不合适

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4楼2015-10-31 20:58:29
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akane1020

金虫 (初入文坛)

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★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:50
ps 引物设计要求至少有3'end的12个碱基跟模板完全一致，而且最好3'end 以G 或C结尾。同时Tm 在60-70中间比较好。

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5楼2015-10-31 21:01:11
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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 宋天雪 at 2015-10-31 23:37:38
可能是引物本身发生了自连，形成大小不一的引物二聚体，跑胶时才会出现许多杂带。

请问如何才能知道自己设计的引物是合格的呢？

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8楼2015-11-01 08:54:53
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hawkinghj

新虫 (初入文坛)

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8楼: Originally posted by zjsuiyuan at 2015-11-01 08:54:53
请问如何才能知道自己设计的引物是合格的呢？
...

如果是用引物设计软件设计的话你所有引物的问题软件都会有提示，然后你还可以做一下熔点曲线看产物是否特异并且找最适温度。
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9楼2015-11-01 09:23:40
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 18:00:03
个人认为是引物的退火温度不合适，看你的图片还是能够看到一条明显的主带。如果你的目标片段在2kb左右的话，我觉得可以试试不同的退火温度。或者就这样小心把它切下来就是了
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
10楼2015-11-01 10:07:57
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