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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆 已有6人参与

本人正在做基因克隆,但是第一步做pcr,发现pcr产物是多带,不明白原因,求各位大牛帮忙!

基因克隆


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yvonne9044

新虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:25
引物的问题吧,能回收留着不用重新设计,不然再看看引物吧,还有你的退火温度,也很重要!

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6楼2015-10-31 23:19:28
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宋天雪

新虫 (初入文坛)

可能是引物本身发生了自连,形成大小不一的引物二聚体,跑胶时才会出现许多杂带。

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7楼2015-10-31 23:37:38
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普通回帖

凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:33
多带就是有好多非特异性条带咯,应该是引物的问题。不过你切胶回收就好了啊,切好就行。
2楼2015-10-31 20:22:53
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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2015-10-31 20:22:53
多带就是有好多非特异性条带咯,应该是引物的问题。不过你切胶回收就好了啊,切好就行。

就是因为非特异性条带太多了,所以才不好切和纯化,无法回收到目的片段,请问引物如何设计呢?

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3楼2015-10-31 20:31:41
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akane1020

金虫 (初入文坛)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:45
可以考虑以下几点:
1. 模板纯吗?
2.引物的binding
3. annealing temperature 是不是不合适

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4楼2015-10-31 20:58:29
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akane1020

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 17:59:50
ps 引物设计要求至少有3'end的12个碱基跟模板完全一致,而且最好3'end 以G 或C结尾。同时Tm 在60-70中间比较好。

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5楼2015-10-31 21:01:11
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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 宋天雪 at 2015-10-31 23:37:38
可能是引物本身发生了自连,形成大小不一的引物二聚体,跑胶时才会出现许多杂带。

请问如何才能知道自己设计的引物是合格的呢?

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8楼2015-11-01 08:54:53
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hawkinghj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
8楼: Originally posted by zjsuiyuan at 2015-11-01 08:54:53
请问如何才能知道自己设计的引物是合格的呢?
...

如果是用引物设计软件设计的话你所有引物的问题软件都会有提示,然后你还可以做一下熔点曲线看产物是否特异并且找最适温度。
9楼2015-11-01 09:23:40
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-01 18:00:03
个人认为是引物的退火温度不合适,看你的图片还是能够看到一条明显的主带。如果你的目标片段在2kb左右的话,我觉得可以试试不同的退火温度。或者就这样小心把它切下来就是了
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索
10楼2015-11-01 10:07:57
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