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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 临床研究 » 二相代谢孵育体系溶液配制
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923158905

铜虫 (小有名气)

[求助] 二相代谢孵育体系溶液配制已有1人参与

想请教些问题，我做的是葡萄糖醛酸化反应，关于孵育体系的配制，我需要配制四种溶液A（UDPGA）；B(D-葡萄糖二酸1,4-内酯，丙甲菌素，MgCl2)；C（样品溶液）；D（UGT酶溶液），然后将溶液冷冻分装，使用时溶解移取适量体积，使孵育体系总体积为100 uL。
（1）UDPGA不太稳定，是不是不可以配成溶液长期冷冻保存，要现配现用？配成溶液冷冻保存有什么影响？
（2）我能把B溶液和D溶液配制在一起，作为一个溶液吗？                                                                                                                                                                                                                                                                               （3）我只知道反复冻融对酶的活性有影响，所以要将酶溶液分装成小份以减少冻融次数，但其他的溶液（A,B,C)还需要分装成小份进行保存吗?                                                                                                                                                                                                                                                               
（4）丙甲菌素在水中的溶解性怎样啊？可以直接用缓冲液配制吗？
           谢谢大家！
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1楼2015-10-17 20:07:25
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923158905

铜虫 (小有名气)
没人回复吗？自己顶一下

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2楼2015-10-18 10:31:03
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tyityi5

新虫 (小有名气)
丙甲菌素溶解性一般，尝试缓冲液吧
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3楼2015-10-19 08:51:31
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man㵘

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
923158905: 金币+30, ★★★很有帮助, 谢谢你的帮助，回答的好详细，赞一个~\(≧▽≦)/~ 2015-10-19 21:46:02
(1)UDPGA要现配现用。如果你真的要配成溶液冷冻，建议挑几个对照化合物，做一下验证实验，看看冷冻后是否有影响。
2）不建议配在一起
3）最好都配成小份，冻存。
(4）丙甲菌素在书中溶解性一般。建议配在DMSO等有机相，配成高浓度，实验时取少量加到反应体系。

PS.做科研，最好每一步都严格按要求来，否则一旦有问题，很难分析原因。如果想节省步奏，改变条件，一定要先做验证实验。
还有个问题，如果你用的是基因工程技术生成的UGT酶，应该就不需要丙甲菌素了吧。我们用microsomes做实验，才加丙甲菌素，目的是穿孔，让UGT释放出来。
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Govern your thoughts when alone, and your tongue when in company.
4楼2015-10-19 15:11:21
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923158905

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tyityi5 at 2015-10-19 08:51:31
丙甲菌素溶解性一般，尝试缓冲液吧

用pH7.4的磷酸盐缓冲液尝试溶解吗？
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5楼2015-10-19 15:41:21
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923158905

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by man㵘 at 2015-10-19 15:11:21
(1)UDPGA要现配现用。如果你真的要配成溶液冷冻，建议挑几个对照化合物，做一下验证实验，看看冷冻后是否有影响。
2）不建议配在一起
3）最好都配成小份，冻存。
(4）丙甲菌素在书中溶解性一般。建议配在DMSO等有 ...

我购买的UGT酶全称：Human UGT2B7 SUPERSOMES
说明如下：This activity is catalyzed by UGT2B7 which is expressed from human UGT2B7 cDNA using a baculovirus expression system. Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes. A membrane preparation using wild type virus (Catalog No.456400) should be used as a control for native activities.

其中有句话：Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes。这是说酶是附着在细胞膜上吗？我看文献中UGT2B7重组酶中加的是丙甲菌素，我就跟着加了，请问是不是肝肠微粒体要加丙甲菌素，而基因工程生产的酶因为没有细胞膜所以就不要加？

关于UDPGA溶液配制问题，由于孵育体系较小，若现配现用，那么UDPGA溶液要配制的体积很小，大约100 uL到500 uL，请问我直接用移液枪移取定量体积缓冲液将UDPGA溶解可以吗？直接将UDPGA固体加入孵育体系应该是不可取的吧？请问你是怎样操作的啊？谢谢！
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6楼2015-10-19 21:41:54
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923158905

铜虫 (小有名气)
问到的另一个回复如下，有同样问题的虫友可以参考一下：
UDPGA通常是现用现配，配好的溶液在-20℃冰箱可以放置，时间最好也不好太长。
B溶液包括辅因子、打孔剂、抑制葡萄糖醛酸水解的抑制剂，B溶液和D溶液最好是分开配制，B溶液中的三个也可以分开配置，这些一般可以放在4℃冰箱里，配一大管，用的时候往体系里面加就行。
除了酶液和UDPGA，其他的稳定性都可以，我们一般是配好了放冰箱，随用随取。
丙甲菌素是多肽，水溶性可以。
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7楼2015-10-22 11:06:54
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左非非考复旦

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 923158905 at 2015-10-22 11:06:54
问到的另一个回复如下，有同样问题的虫友可以参考一下：
UDPGA通常是现用现配，配好的溶液在-20℃冰箱可以放置，时间最好也不好太长。
B溶液包括辅因子、打孔剂、抑制葡萄糖醛酸水解的抑制剂，B溶液和D溶液最好是 ...

我现在是建立孵育体系，建立的体系没有代谢，我的体系是
肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸单内酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM）
做的时候，先将丙甲菌素与肝S9置于冰上15min进行穿孔，后加入其他试剂预孵育5分钟，最后加入UDPGA启动反应
我用对硝基苯酚作为阳性对照，也没有代谢，肝S9应该没有问题额，因为做一相的时候，就有活性，现在不知道是怎么回事额，
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不抛弃不放弃
8楼2016-01-25 18:35:31
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左非非考复旦

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 923158905 at 2015-10-19 21:41:54
我购买的UGT酶全称：Human UGT2B7 SUPERSOMES
说明如下：This activity is catalyzed by UGT2B7 which is expressed from human UGT2B7 cDNA using a baculovirus expression system. Baculovirus infected insec ...

我现在是建立孵育体系，建立的体系没有代谢，我的体系是
肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸单内酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM）
做的时候，先将丙甲菌素与肝S9置于冰上15min进行穿孔，后加入其他试剂预孵育5分钟，最后加入UDPGA启动反应
我用对硝基苯酚作为阳性对照，也没有代谢，肝S9应该没有问题额，因为做一相的时候，就有活性，现在不知道是怎么回事额，
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不抛弃不放弃
9楼2016-01-25 18:35:47
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梦庆双飞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 左非非考复旦 at 2016-01-25 18:35:47
我现在是建立孵育体系，建立的体系没有代谢，我的体系是
肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸单内酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM）
做的时候，先将丙甲菌素与肝S9置于冰上15min进 ...

请问找到原因了吗
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10楼2016-03-11 14:51:46
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