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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 临床研究 » 二相代谢孵育体系溶液配制
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923158905

铜虫 (小有名气)

[求助] 二相代谢孵育体系溶液配制 已有1人参与

想请教些问题，我做的是葡萄糖醛酸化反应，关于孵育体系的配制，我需要配制四种溶液A（UDPGA）；B(D-葡萄糖二酸1,4-内酯，丙甲菌素，MgCl2)；C（样品溶液）；D（UGT酶溶液），然后将溶液冷冻分装，使用时溶解移取适量体积，使孵育体系总体积为100 uL。
（1）UDPGA不太稳定，是不是不可以配成溶液长期冷冻保存，要现配现用？配成溶液冷冻保存有什么影响？
（2）我能把B溶液和D溶液配制在一起，作为一个溶液吗？                                                                                                                                                                                                                                                                               （3）我只知道反复冻融对酶的活性有影响，所以要将酶溶液分装成小份以减少冻融次数，但其他的溶液（A,B,C)还需要分装成小份进行保存吗?                                                                                                                                                                                                                                                               
（4）丙甲菌素在水中的溶解性怎样啊？可以直接用缓冲液配制吗？
           谢谢大家！
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1楼 2015-10-17 20:07:25
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左非非考复旦

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 923158905 at 2015-10-19 21:41:54
我购买的UGT酶全称：Human UGT2B7 SUPERSOMES
说明如下：This activity is catalyzed by UGT2B7 which is expressed from human UGT2B7 cDNA using a baculovirus expression system. Baculovirus infected insec ...

我现在是建立孵育体系，建立的体系没有代谢，我的体系是
肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸单内酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM）
做的时候，先将丙甲菌素与肝S9置于冰上15min进行穿孔，后加入其他试剂预孵育5分钟，最后加入UDPGA启动反应
我用对硝基苯酚作为阳性对照，也没有代谢，肝S9应该没有问题额，因为做一相的时候，就有活性，现在不知道是怎么回事额，
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不抛弃不放弃
9楼2016-01-25 18:35:47
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923158905

铜虫 (小有名气)
没人回复吗？自己顶一下

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2楼2015-10-18 10:31:03
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tyityi5

新虫 (小有名气)
丙甲菌素溶解性一般，尝试缓冲液吧
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3楼2015-10-19 08:51:31
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man㵘

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
923158905: 金币+30, ★★★很有帮助, 谢谢你的帮助，回答的好详细，赞一个~\(≧▽≦)/~ 2015-10-19 21:46:02
(1)UDPGA要现配现用。如果你真的要配成溶液冷冻，建议挑几个对照化合物，做一下验证实验，看看冷冻后是否有影响。
2）不建议配在一起
3）最好都配成小份，冻存。
(4）丙甲菌素在书中溶解性一般。建议配在DMSO等有机相，配成高浓度，实验时取少量加到反应体系。

PS.做科研，最好每一步都严格按要求来，否则一旦有问题，很难分析原因。如果想节省步奏，改变条件，一定要先做验证实验。
还有个问题，如果你用的是基因工程技术生成的UGT酶，应该就不需要丙甲菌素了吧。我们用microsomes做实验，才加丙甲菌素，目的是穿孔，让UGT释放出来。
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Govern your thoughts when alone, and your tongue when in company.
4楼2015-10-19 15:11:21
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