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923158905铜虫 (小有名气)
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二相代谢孵育体系溶液配制已有1人参与
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想请教些问题，我做的是葡萄糖醛酸化反应，关于孵育体系的配制，我需要配制四种溶液A（UDPGA）；B(D-葡萄糖二酸1,4-内酯，丙甲菌素，MgCl2)；C（样品溶液）；D（UGT酶溶液），然后将溶液冷冻分装，使用时溶解移取适量体积，使孵育体系总体积为100 uL。 （1）UDPGA不太稳定，是不是不可以配成溶液长期冷冻保存，要现配现用？配成溶液冷冻保存有什么影响？ （2）我能把B溶液和D溶液配制在一起，作为一个溶液吗？ （3）我只知道反复冻融对酶的活性有影响，所以要将酶溶液分装成小份以减少冻融次数，但其他的溶液（A,B,C)还需要分装成小份进行保存吗? （4）丙甲菌素在水中的溶解性怎样啊？可以直接用缓冲液配制吗？ 谢谢大家！ |
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我购买的UGT酶全称：Human UGT2B7 SUPERSOMES 说明如下：This activity is catalyzed by UGT2B7 which is expressed from human UGT2B7 cDNA using a baculovirus expression system. Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes. A membrane preparation using wild type virus (Catalog No.456400) should be used as a control for native activities. 其中有句话：Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes。这是说酶是附着在细胞膜上吗？我看文献中UGT2B7重组酶中加的是丙甲菌素，我就跟着加了，请问是不是肝肠微粒体要加丙甲菌素，而基因工程生产的酶因为没有细胞膜所以就不要加？ 关于UDPGA溶液配制问题，由于孵育体系较小，若现配现用，那么UDPGA溶液要配制的体积很小，大约100 uL到500 uL，请问我直接用移液枪移取定量体积缓冲液将UDPGA溶解可以吗？直接将UDPGA固体加入孵育体系应该是不可取的吧？请问你是怎样操作的啊？谢谢！ |
6楼2015-10-19 21:41:54
923158905
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2楼2015-10-18 10:31:03
3楼2015-10-19 08:51:31
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(1)UDPGA要现配现用。如果你真的要配成溶液冷冻，建议挑几个对照化合物，做一下验证实验，看看冷冻后是否有影响。 2）不建议配在一起 3）最好都配成小份，冻存。 (4）丙甲菌素在书中溶解性一般。建议配在DMSO等有机相，配成高浓度，实验时取少量加到反应体系。 PS.做科研，最好每一步都严格按要求来，否则一旦有问题，很难分析原因。如果想节省步奏，改变条件，一定要先做验证实验。 还有个问题，如果你用的是基因工程技术生成的UGT酶，应该就不需要丙甲菌素了吧。我们用microsomes做实验，才加丙甲菌素，目的是穿孔，让UGT释放出来。 |
4楼2015-10-19 15:11:21