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小白兔的愿望

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[求助] [求助] 流式死活染 & 单细胞门控设置被质疑，如何优化并解释？已有1人参与

大家好，我的流式 gating 最近被实验室里一个非常严谨的老师质疑了两点：

死活染电压过高
审稿人和老师都指出，我在 viability dye（Fixable Viability Dye eFluor™ 506）通道的电压（PMT）设得太高，导致阴性和阳性之间的分界不够清晰。
理想情况下，死细胞的信号很亮，活细胞阴性峰应该落在 0–10³ 之间，这样阳性/阴性分离更明显。
我现在的图（P2）分辨率不高，阴性和阳性过渡区模糊，可能会造成 gate 不够干净。
老师建议调低电压或调整 logicle scale 后再 gating。审稿人也认为虽然我最后还是比较准确地圈出了 live cells，但分辨率不足可能会影响后续 singlet gate 的干净程度。
单细胞 gate（FSC-A vs FSC-H）太陡
我的 singlet gate（P3）是参考文献画的，目的是排除 doublets 和紧密贴在一起的细胞（clustered cells），尤其在中性粒细胞样本里这种情况不少。
但老师认为我的线太陡，漏掉了一团细胞，怀疑里面可能有一部分是我要分析的目标细胞。
审稿人也提到：理想的单细胞分布是沿对角线（FSC-H 稍低于 FSC-A），如果 gate 过陡，可能会错排一些正常细胞。我的 singlet yield 目前只有 71% live cells，他建议如果不预期样本有很多 doublets/debris，可以把 gate 放得更“平缓”一点。
📌 我的困惑

我参考的文献确实是这样画 singlet gate 的，去掉的那部分是形态明显异常、可能是粘连的细胞。但老师觉得可能“误伤”了正常细胞。
如果我改成平缓一些，最后目的细胞的比例会升高一些，但这样会不会引入假阳性？
死活染的电压我确实一开始设高了，调 logicle scale 有轻微改善，但阴/阳性还是没法泾渭分明。大家觉得这个对结果的影响大吗？
💡 想请教大家

在死活染分辨率低的情况下，有没有后处理或重跑时的最佳调整方法？
单细胞 gate 陡 vs 平缓，你们在 rare cell subset 分析时是怎么权衡灵敏度和特异性的？
有没有推荐的参考文献或示例图，可以用来和老师解释“为什么我这样圈门是合理的”？
附图（P2：死活染；P3：单细胞 gate）👇

[ 发自手机版 https://muchong.com/3g ]

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