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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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小白兔的愿望

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[求助] [求助] 流式死活染 & 单细胞门控设置被质疑,如何优化并解释? 已有1人参与

大家好,我的流式 gating 最近被实验室里一个非常严谨的老师质疑了两点:

死活染电压过高
审稿人和老师都指出,我在 viability dye(Fixable Viability Dye eFluor™ 506)通道的电压(PMT)设得太高,导致阴性和阳性之间的分界不够清晰。
理想情况下,死细胞的信号很亮,活细胞阴性峰应该落在 0–10³ 之间,这样阳性/阴性分离更明显。
我现在的图(P2)分辨率不高,阴性和阳性过渡区模糊,可能会造成 gate 不够干净。
老师建议调低电压或调整 logicle scale 后再 gating。审稿人也认为虽然我最后还是比较准确地圈出了 live cells,但分辨率不足可能会影响后续 singlet gate 的干净程度。
单细胞 gate(FSC-A vs FSC-H)太陡
我的 singlet gate(P3)是参考文献画的,目的是排除 doublets 和紧密贴在一起的细胞(clustered cells),尤其在中性粒细胞样本里这种情况不少。
但老师认为我的线太陡,漏掉了一团细胞,怀疑里面可能有一部分是我要分析的目标细胞。
审稿人也提到:理想的单细胞分布是沿对角线(FSC-H 稍低于 FSC-A),如果 gate 过陡,可能会错排一些正常细胞。我的 singlet yield 目前只有 71% live cells,他建议如果不预期样本有很多 doublets/debris,可以把 gate 放得更“平缓”一点。
📌 我的困惑

我参考的文献确实是这样画 singlet gate 的,去掉的那部分是形态明显异常、可能是粘连的细胞。但老师觉得可能“误伤”了正常细胞。
如果我改成平缓一些,最后目的细胞的比例会升高一些,但这样会不会引入假阳性?
死活染的电压我确实一开始设高了,调 logicle scale 有轻微改善,但阴/阳性还是没法泾渭分明。大家觉得这个对结果的影响大吗?
💡 想请教大家

在 死活染分辨率低 的情况下,有没有后处理或重跑时的最佳调整方法?
单细胞 gate 陡 vs 平缓,你们在 rare cell subset 分析时是怎么权衡灵敏度和特异性的?
有没有推荐的参考文献或示例图,可以用来和老师解释“为什么我这样圈门是合理的”?
附图(P2:死活染;P3:单细胞 gate)👇

[求助] 流式死活染 & 单细胞门控设置被质疑,如何优化并解释?


[ 发自手机版 https://muchong.com/3g ]
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nono2009

无虫

No gains, no pains.

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这个是专业问题了。本版讨论论文投稿中的一般性问题。建议去相关专业版交流。
发自小木虫手机客户端
2楼2025-08-10 10:17:30
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