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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 急，之前提质粒浓度正常，这段时间提出来浓度都很低为什么
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小小八八

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急，之前提质粒浓度正常，这段时间提出来浓度都很低为什么已有8人参与

已经将我的目地基因导入T载，提质粒进行后续实验，之前提的质粒都有200ng/ul左右，最近两次所提出的质粒浓度很低，只有50ng/ul。
质粒提取试剂盒肯定没问题，因为实验室其他同学也在做，都正常
之前几次和现在的区别就是我从同一个平板的不同区域挑的菌，这个菌都是来自同一根液体LB试管（难道当时我从液体接到平板的时候就挑了不同质粒拷贝数的菌液？）然后提出来浓度有200左右的菌平板上已经被我刮得很干净了，所以我换了另一个区域刮（总共四个区域），有没有可能是amp失效了，所以质粒丢失，那么我现在想到两个方法：
1.从原来那个刮完的平板上再刮菌转接平板，但如果是amp失效的情况下，那这个区域的菌质粒是不是也会丢失，如果是，那这个方法应该不能提高质粒浓度
2我当时提过一次原来区域菌的质粒，测了浓度有170多ng/ul，用了一部分，还有几ul。那我将质粒重新转化DH5a，会改善这个情况么？？？ 两个方法哪个更有效？
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1楼2015-10-16 11:39:32
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liping121200

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小小八八 at 2015-10-16 16:47:56
那拿我提出来的50多浓度的质粒转化可以吗？为什么会出现这种情况呢？是不是因为平板上的amp失效了，所以质粒部分丢失？如果是这样的话是不是说明我原来那个平板上所有4个区域的菌质粒都部分丢失了？...

挑菌挑的是单菌落，摇菌的时候也会加amp的呀，应该不会存在amp失效的问题，如果是amp失效，你的菌可能就摇不起来，即使摇菌不加amp你提出来的质粒就有问题了，很有可能提出来的就不是你想要的质粒。要是你之前170的浓度质粒用的比较好，就用这个，比较保险。
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好好学习，天天向上
19楼2015-10-17 09:52:01
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gookies

新虫 (初入文坛)
楼主最后是怎么解决这个问题的？
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27楼2015-10-19 09:23:36
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普通回帖

Eternity宇

禁虫 (著名写手)
★ ★
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小小八八: 金币+2, ★有帮助 2015-10-16 12:04:02
本帖内容被屏蔽
2楼2015-10-16 11:53:08
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 11:53:08
重新转的话比较稳妥一点儿，因为不知道你摇菌的时间和Amp加的量所以不太敢确定是不是摇的问题……

都是过夜摇菌，amp终浓度都是一样的，我提质粒提了很多次了，操作都是一样的，应该不是摇菌的问题，那我重新转化的话我的质粒浓度能提高回来吗？好怕质粒浓度就上不去了那我后面酶切连接都没法做了，已经做了4个月酶切连接，一点进展都没有，这几次提质粒发现质粒浓度都上不去
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3楼2015-10-16 12:03:48
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
还想问一下，我如果用提出来的浓度50多的质粒还是说要用浓度170多的质粒重新转化的话我的质粒浓度能提高回来吗？哪个效果更好？好怕质粒浓度就上不去了那我后面酶切连接都没法做了，已经做了4个月酶切连接，一点进展都没有，这几次提质粒发现质粒浓度都上不去
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4楼2015-10-16 12:05:43
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
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5楼2015-10-16 12:10:35
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zyyyyyyy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-16 20:10:45
你抽质粒的方法是不是有点问题，虽然是是试剂盒。 建议，将菌摇的浓一点，抽质粒的时候注意细节，最后洗脱下来再过一遍柱子
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6楼2015-10-16 12:15:13
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zyyyyyyy at 2015-10-16 12:15:13
你抽质粒的方法是不是有点问题，虽然是是试剂盒。 建议，将菌摇的浓一点，抽质粒的时候注意细节，最后洗脱下来再过一遍柱子

肯定没有，都是一个公司的试剂盒，我提了很多次，也肯定不是摇菌的问题，我上次摇了21个小时提的质粒也只有70ng/ul，之前浓度200多的时候都是过夜提的，也就摇了13-15个小时左右
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7楼2015-10-16 13:02:16
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 12:10:35
重新转化的话和质粒的浓度无关，你做之前最好跑个电泳检验一下
...

嗯，谢谢，我会试试
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8楼2015-10-16 13:03:44
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
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9楼2015-10-16 14:13:16
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小小八八

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-10-16 14:13:16
摇了21个小时浓度还不行，菌有问题……
...

菌有问题是指质粒丢失吗？那我把提出来的质粒重新转化一次可以解决这个问题吗
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10楼2015-10-16 14:39:41
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