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汕头大学海洋科学接受调剂
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日光海

铜虫 (小有名气)

[求助] Red敲除,如何消除或降低假阳性

小弟最近做Red敲除,做了5个月了。最近遇到的问题是,敲除后12h内没长,24h后长出很小的单菌落,鉴定全是假阳性。
操作如下:平板挑单菌落(假单胞菌,L-阿拉伯糖-)接25ml(50mL管子)LB,四环素(pRKaraRed质粒)浓度12.5μg过夜培养做种子液。第二天早晨,1:100接种到新鲜LB+四环素12.5μg,加入0.2%的L-阿拉伯糖。培养至OD=0.4~0.5,冰浴菌液30min,然后离心浓缩,预冷超纯水洗涤四次,预冷10%甘油洗涤四次,200μL10%甘油重悬,取100μL+1μg打靶片段(来自pk18mobsacB),2500V,200Ω,2.5μF,电击时间显示5.1ms,加入室温LB 1mL,30℃孵育2~3h,离心,浓缩后全部涂板四环素+卡那(均10μg)平板,结果24h后才长出来一些小菌落,鉴定全是假阳性。
求大神赐教,为什么会出现这些假阳性?麻烦有经验的虫友支招怎么去除或减少假阳性?
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周老湿
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日光海

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 喵喵思密达 at 2017-03-13 09:39:13
我的问题和楼主的一样,不知道楼主现在可解决了?

后续尝试过这个方案,未解决。转而用同源臂质粒的老方案成功敲除了
周老湿
3楼2017-11-16 10:15:19
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喵喵思密达

新虫 (初入文坛)

我的问题和楼主的一样,不知道楼主现在可解决了?
2楼2017-03-13 09:39:13
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stogqy

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 日光海 at 2017-11-16 10:15:19
后续尝试过这个方案,未解决。转而用同源臂质粒的老方案成功敲除了...

请问你做的是恶臭假单胞菌吗?我最近做敲除也遇到类似问题,特别头疼,能不能交流一下?
4楼2018-08-22 09:56:05
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日光海

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by stogqy at 2018-08-22 09:56:05
请问你做的是恶臭假单胞菌吗?我最近做敲除也遇到类似问题,特别头疼,能不能交流一下?...

你是Red敲除还是同源臂质粒敲除?有兴趣你可以尝试一下crispr/cas9敲除
周老湿
5楼2018-08-23 09:12:35
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