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日光海铜虫 (小有名气)
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[求助]
Red敲除，如何消除或降低假阳性
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小弟最近做Red敲除，做了5个月了。最近遇到的问题是，敲除后12h内没长，24h后长出很小的单菌落，鉴定全是假阳性。 操作如下：平板挑单菌落（假单胞菌，L-阿拉伯糖-）接25ml（50mL管子）LB，四环素（pRKaraRed质粒）浓度12.5μg过夜培养做种子液。第二天早晨，1:100接种到新鲜LB+四环素12.5μg，加入0.2%的L-阿拉伯糖。培养至OD=0.4~0.5，冰浴菌液30min，然后离心浓缩，预冷超纯水洗涤四次，预冷10%甘油洗涤四次，200μL10%甘油重悬，取100μL+1μg打靶片段（来自pk18mobsacB），2500V，200Ω，2.5μF，电击时间显示5.1ms，加入室温LB 1mL，30℃孵育2~3h，离心，浓缩后全部涂板四环素+卡那（均10μg）平板，结果24h后才长出来一些小菌落，鉴定全是假阳性。 求大神赐教，为什么会出现这些假阳性？麻烦有经验的虫友支招怎么去除或减少假阳性？ |
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