应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 超级短片段如何PCR或者其他方式引入载体？以及Cre/LoxP问题。。
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
111/2返回列表12下一页
查看: 1730  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

[求助] 超级短片段如何PCR或者其他方式引入载体？以及Cre/LoxP问题。。

1、目的片段66bp左右，两边打算加几个酶切位点，加好大约100bp，这个长度好尴尬。。怎么处理比较好？

最终打算做成这个样子（如图）
http://muchongimg.xmcimg.com/data/b ... _1442904607_413.png
其中，黄色对应某模板，蓝色的是我打算在引物两边加的酶切位点。。这个PCR回收效率似乎超级低是吧。。


2、Cre/LoxP系统中的loxP核心序列8bp可以是任意序列么？我知道两个loxP的核心序列要相同或者相反方向，只是这8bp是不是可以任意设计的？
（因为看到百度里这么说的：Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。）

3、据说Cre/loxP是可逆过程，那么，两个同向loxP之间的基因敲除的彻底么？两个反向LoxP之间的基因是不是可能被倒装后又正过来了？

超级短片段如何PCR或者其他方式引入载体？以及Cre/LoxP问题。。
xxxx.png
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-09-22 14:55:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR短片段可以尝试用IN-FUSION方法进行构建
赞一下 回复此楼
2楼2015-09-23 14:20:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 高gaoeryang at 2015-09-23 14:20:37
PCR短片段可以尝试用IN-FUSION方法进行构建

一直在用infusion，但是没试过这么短的片段。。短片段infusion你试过没？
赞一下 回复此楼
3楼2015-09-23 14:49:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-23 14:49:32
一直在用infusion，但是没试过这么短的片段。。短片段infusion你试过没？...

做过，IN-FUSION可以覆盖0.05-15kb的大小片段。
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-24 16:25:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 高gaoeryang at 2015-09-24 16:25:55
做过，IN-FUSION可以覆盖0.05-15kb的大小片段。...

你说的50bp指的是包括同源臂在内50bp还是不包括同源臂只是插入片段就至少要50bp？
赞一下 回复此楼
5楼2015-09-25 12:46:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DanceMacabre

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kangaroo0513: 金币+1, ★有帮助, 神马叫100p？难道是pmol？以前做过crispr的退火后连接没成功。。555 2015-09-25 20:26:20
把序列加上酶切位点之后，直接合成。将正反向引物稀释成100P的浓度，各5ul，加水至15ul体系，沸水浴5min，至自然冷却。将载体双酶切，曝露出酶切位点，将退火引物与载体用连接酶连接即可

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-25 13:04:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DanceMacabre

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by DanceMacabre at 2015-09-25 13:04:11
把序列加上酶切位点之后，直接合成。将正反向引物稀释成100P的浓度，各5ul，加水至15ul体系，沸水浴5min，至自然冷却。将载体双酶切，曝露出酶切位点，将退火引物与载体用连接酶连接即可
...

金币哦

发自小木虫Android客户端
回复此楼
7楼2015-09-25 13:26:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小米粒2015

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-25 12:46:06
你说的50bp指的是包括同源臂在内50bp还是不包括同源臂只是插入片段就至少要50bp？...

Vazyme的one step cloning kit,可以插入50bp-10kb的片段，价格是in-fusion的五分之一。效果没话说，国产第一品牌
赞一下 回复此楼
8楼2015-09-25 14:22:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
kangaroo0513: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-09-25 20:24:59
引用回帖:
5楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-25 12:46:06
你说的50bp指的是包括同源臂在内50bp还是不包括同源臂只是插入片段就至少要50bp？...

DNA片段，不含同源臂
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-25 15:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我等风起

铜虫 (初入文坛)
楼主，不知是否还有cre-loxp系统，可交换不？
赞一下 回复此楼
10楼2017-02-15 16:15:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kangaroo0513 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕322分 +10 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 10/500 2026-04-01 22:19 by Dyhoer
[考研] 349求调剂 +6 吃的不少 2026-04-01 6/300 2026-04-01 17:55 by JYD2011
[考研] 326求调剂 +4 崽崽仔 2026-03-31 4/200 2026-04-01 09:58 by 我的船我的海
[考研] 322求调剂 +4 熹僖XX 2026-03-31 4/200 2026-04-01 08:21 by JourneyLucky
[考研] 求调剂：085600材料与化工，考材科基，总分319 +17 678lucky 2026-03-31 21/1050 2026-04-01 01:40 by 1018329917
[考研] 070300化学专业279调剂 +10 哈哈哈^_^ 2026-03-31 10/500 2026-03-31 23:13 by liu823948201
[考研] 277跪求调剂 +8 1915668 2026-03-27 13/650 2026-03-31 14:58 by 王亮_大连医科大
[考研] 08工科，295，接受跨专业调剂 +6 lmnlzy 2026-03-30 6/300 2026-03-31 10:04 by cal0306
[考研] 083000学硕274求调剂 +12 Li李鱼 2026-03-26 12/600 2026-03-31 10:01 by cal0306
[考研] 083000环境科学与工程调剂，总分281 +4 橙子（胜意） 2026-03-30 4/200 2026-03-31 00:44 by Linzejun
[考研] 293求调剂 +3 末未mm 2026-03-30 5/250 2026-03-30 17:23 by 王保杰33
[考研] 0703 化学 求调剂，一志愿山东大学 342 分 +7 Shern—- 2026-03-28 7/350 2026-03-30 16:31 by nothing投稿中
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 16:05 by shuang5186
[考研] 283求调剂（080500） +14 A child 2026-03-27 14/700 2026-03-30 12:06 by 探123
[考研] 348求调剂 +6 小懒虫不懒了 2026-03-28 6/300 2026-03-30 10:29 by Evan_Liu
[考研] 311求调剂 +10 lin0039 2026-03-26 10/500 2026-03-30 10:26 by herarysara
[考研] 材料求调剂一志愿哈工大324 +7 闫旭东 2026-03-28 9/450 2026-03-28 08:51 by Xu de nuo
[考研] 070300化学求调剂 +4 起个名咋这么难 2026-03-27 4/200 2026-03-27 21:39 by 83503孙老师
[考研] 324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-26 5/250 2026-03-27 10:33 by wangjy2002
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭