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kangaroo0513新虫 (正式写手)
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超级短片段如何PCR或者其他方式引入载体？以及Cre/LoxP问题。。
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1、目的片段66bp左右，两边打算加几个酶切位点，加好大约100bp，这个长度好尴尬。。怎么处理比较好？ 最终打算做成这个样子（如图） http://muchongimg.xmcimg.com/data/b ... _1442904607_413.png 其中，黄色对应某模板，蓝色的是我打算在引物两边加的酶切位点。。这个PCR回收效率似乎超级低是吧。。 2、Cre/LoxP系统中的loxP核心序列8bp可以是任意序列么？我知道两个loxP的核心序列要相同或者相反方向，只是这8bp是不是可以任意设计的？ （因为看到百度里这么说的：Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。） 3、据说Cre/loxP是可逆过程，那么，两个同向loxP之间的基因敲除的彻底么？两个反向LoxP之间的基因是不是可能被倒装后又正过来了？  xxxx.png |
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kangaroo0513: 金币+1, ★有帮助, 神马叫100p？难道是pmol？以前做过crispr的退火后连接没成功。。555 2015-09-25 20:26:20
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kangaroo0513: 金币+1, ★有帮助, 神马叫100p？难道是pmol？以前做过crispr的退火后连接没成功。。555 2015-09-25 20:26:20
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把序列加上酶切位点之后，直接合成。将正反向引物稀释成100P的浓度，各5ul，加水至15ul体系，沸水浴5min，至自然冷却。将载体双酶切，曝露出酶切位点，将退火引物与载体用连接酶连接即可 发自小木虫Android客户端 |
6楼2015-09-25 13:04:11
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