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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？
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冰扣儿

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？ 已有9人参与

各位大神好！marker从上到下是15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500.这个电泳图是7584bp的质粒跑的，双酶切的片段50bp，所有整齐像一字的条带都是双酶切的，两条特别的条带是原质粒，原质粒跑成这样能割胶回收吗？

质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？
QQ图片  09 09.jpg
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1楼 2015-09-10 00:15:16
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-10 23:04:40
有点奇怪啊，原质粒由于超螺旋构象，应该跑得比酶切的快才对，怎么会在上面呢
话说原质粒为什么要切胶回收呢，重新转化提质粒不就好了？
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2楼2015-09-10 07:27:51
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这也不对啊，切开的应该跑的慢啊。
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3楼2015-09-10 09:16:50
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-11 14:21:21
谢谢指点 因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 回首之后连接不出来 图片里是我的连接体系 不知道为什么 若你能帮我分析出问题在哪里 我请你吃好多好多果冻

QQ图片 连接体系.jpg
...

字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。

不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。

150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。

“回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了，

1，载体双酶切，
如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。

2，片段酶切，
片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。

3，连接，
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。
如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。

大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~
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冰扣儿
21楼2015-09-11 19:33:24
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普通回帖

冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-10 07:27:51
有点奇怪啊，原质粒由于超螺旋构象，应该跑得比酶切的快才对，怎么会在上面呢
话说原质粒为什么要切胶回收呢，重新转化提质粒不就好了？

我要割胶回收连接目的片段
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4楼2015-09-10 11:20:43
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2015-09-10 09:16:50
你这也不对啊，切开的应该跑的慢啊。

是啊 所以才问可不可以割胶回收呢 这个提的质粒做过293T的转染了 有绿色荧光 也做过两个酶切位点的单酶切 都正常 唯有原质粒跑出来的电泳不正常
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5楼2015-09-10 11:31:23
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-09-10 07:27:51
有点奇怪啊，原质粒由于超螺旋构象，应该跑得比酶切的快才对，怎么会在上面呢
话说原质粒为什么要切胶回收呢，重新转化提质粒不就好了？

这个质粒也做过两个酶切位点的分别单酶切 正常 转染过293T 有绿色荧光 重新转化的感受态 涂板 也长出单菌落了 就是这个原质粒跑的电泳不知道是不正常还是没跑开
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6楼2015-09-10 11:34:31
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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6楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-10 11:34:31
这个质粒也做过两个酶切位点的分别单酶切 正常 转染过293T 有绿色荧光 重新转化的感受态 涂板 也长出单菌落了 就是这个原质粒跑的电泳不知道是不正常还是没跑开...

你一样的个东西整这么多孔干啥？省着点琼脂做果冻吃不好么？这样得切下来多少？后面胶回收一路也是麻烦，一遍遍过柱子不累啊？

切吧，酶切产物大小符合预期

干这个事情，上个没有切的质粒，只是让你看看是不是切了之后跟原始质粒不一样了。质粒在agaraose gel上怎么跑，跑多快，陈词滥调的东西，管他干啥，跟你怎么抽的还有关系呢。你现在区别明显，目的达到，ok
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7楼2015-09-10 13:16:47
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-10 11:31:23
是啊 所以才问可不可以割胶回收呢 这个提的质粒做过293T的转染了 有绿色荧光 也做过两个酶切位点的单酶切 都正常 唯有原质粒跑出来的电泳不正常...

你原质粒多长时间啦
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8楼2015-09-10 14:05:19
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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切后确定大小正确，就胶回收，遇到过质粒电泳异常的，测序证明没问题
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9楼2015-09-10 14:20:49
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2015-09-10 14:05:19
你原质粒多长时间啦...

一个星期啊 提了不久
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10楼2015-09-10 15:09:44
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