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质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？ 已有9人参与
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各位大神好！marker从上到下是15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500.这个电泳图是7584bp的质粒跑的，双酶切的片段50bp，所有整齐像一字的条带都是双酶切的，两条特别的条带是原质粒，原质粒跑成这样能割胶回收吗？ QQ图片 09 09.jpg |
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biostar2009
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字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！ “因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ” 这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。 不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。 150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。 “回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了， 1，载体双酶切， 如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。 2，片段酶切， 片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。 3，连接， 必须带上不含插入片段只有载体的对照。 一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。 如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。 大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~ |
冰扣儿21楼2015-09-11 19:33:24
evangelina
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2楼2015-09-10 07:27:51
3楼2015-09-10 09:16:50
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