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冰扣儿

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[求助] 质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？已有9人参与

各位大神好！marker从上到下是15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500.这个电泳图是7584bp的质粒跑的，双酶切的片段50bp，所有整齐像一字的条带都是双酶切的，两条特别的条带是原质粒，原质粒跑成这样能割胶回收吗？

QQ图片 09 09.jpg

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优秀，是一种习惯！

1楼 2015-09-10 00:15:16

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biostar2009

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引用回帖:

16楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-11 14:21:21
谢谢指点因为回收效率低所以想多跑几个孔富集到一个柱子上回首之后连接不出来图片里是我的连接体系不知道为什么若你能帮我分析出问题在哪里我请你吃好多好多果冻

QQ图片连接体系.jpg
...

字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。

不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。

150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。

“回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了，

1，载体双酶切，
如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。

2，片段酶切，
片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。

3，连接，
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。
如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。

大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~