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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-11 14:21:21
谢谢指点 因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 回首之后连接不出来 图片里是我的连接体系 不知道为什么 若你能帮我分析出问题在哪里 我请你吃好多好多果冻

QQ图片 连接体系.jpg
...

字挺漂亮嘛!~哇哈哈哈,好吧,多说几句!

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑,若是效率低,愈发要减少体积,你这么多孔,孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么?这样等于增加了胶体积,降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言,吸附效率与DNA浓度关系很大,越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面,切的时候争取小点。

不过话说回来,一般而言还不至于低到影响连接,所以你这里或许还会有其他问题。

150 ng质粒用于连接,对于一般的片段而言足够了,除非你片段很长,这时候就得计算一下了,一般而言片段需要过量一点。

“回首之后连接不出来”,这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点,我这样说好了,

1,载体双酶切,
如果是空载,掉下来的片段不到80bp以下的,完全可以直接过柱回收,没必要跑胶分离,现在绝大多数公司的内切酶,在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切,一般也不需要脱磷,脱磷对于单酶切而言一般情况下必要,但是对于双酶切,其实可以不做,不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。

2,片段酶切,
片段,即便加上保护碱基,酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言,摩尔数也一般很高,所以酶切经常不彻底,可以稍微多切一会,取决于你用的酶,特别是考虑星号活性。

3,连接,
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言,只要是克隆熟相对于对照有明显区别,都非常有可能拿到阳性克隆,不是说一定要对照少片段多,经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆,直接单酶切平末端的载体,不脱磷连接PCR产物,PCR产物两头没有磷,全靠载体连,那结果就是对照密密麻麻,连接零星几个,这样就对了。
如果连接没长,这时候一定要关注一下对照,如果对照也一个没长,不是说载体做得太好了,而是好过了头,这时候要减少双酶切时间,不要脱磷,增大载体连接量再试。

大多数而言,以上分析能够解决问题,等待你的果冻!~

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21楼2015-09-11 19:33:24
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冰扣儿

新虫 (小有名气)

引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛!~哇哈哈哈,好吧,多说几句!

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑,若是效率低,愈发要减少体积,你这么多孔,孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么?这样 ...

大神果然是大神,一句话省去我好多工作量,就这个电泳图胶回收我会收到凌晨两点多。我刚进实验室,之前没有师兄师姐做过这方面,现在老师让我建立这个平台体系,可否请教大神扣扣号?以后还希望大神多多指点!你喜欢吃什么牌子什么口味的果冻?地址?我正要去超市。
优秀,是一种习惯!
22楼2015-09-12 14:15:59
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

内容已删除
23楼2015-09-13 13:47:40
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

遇到过,我的质粒也是大约7kbp,跑出来是15K+。切下来继续做吧,如果是富集,是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克,量就足够了。连接连不上是不是黏性啊,我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入的DNA片段大小多少,再加1微升水吧,总体积是10,感觉会好一些。
24楼2015-09-13 15:20:59
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冰扣儿

新虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-13 13:47:40


果冻留着吧,MM做实验不要熬太晚,学会自主学习,寻求帮助,祝实验顺利。...

果冻已经买好了,给你寄过去吧,我说过请你吃了,君子一言驷马难追!而且,我有工资,平时花不完,哈哈。已经连接上了,看了很多帖子,自己最后重设了体系,还没送去测序,但是转化效果还不错。多谢指点!
优秀,是一种习惯!
25楼2015-09-14 11:54:23
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冰扣儿

新虫 (小有名气)

引用回帖:
24楼: Originally posted by 沉默的独角兽 at 2015-09-13 15:20:59
遇到过,我的质粒也是大约7kbp,跑出来是15K+。切下来继续做吧,如果是富集,是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克,量就足够了。连接连不上是不是黏性啊,我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入 ...

多谢!已经连上了,最后重设了体系,根据这个公式连计算片段和载体分别需要的量。公式是:插入片段体积(μl) = T载体量(ng)x 插入片段大小(kb)÷T载体大小(kb)x插入片段与T载体的摩尔比(3~10:1) ÷ 插入片段浓度(ng/μl)。载体与片段相差不大一般用5:1,大的话就用8:1.
优秀,是一种习惯!
26楼2015-09-14 11:59:14
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冰扣儿

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛!~哇哈哈哈,好吧,多说几句!

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑,若是效率低,愈发要减少体积,你这么多孔,孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么?这样 ...

我把你的金玉良言粘贴到word打印出来了 哈哈
优秀,是一种习惯!
27楼2015-09-14 12:02:12
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