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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-11 14:21:21
谢谢指点 因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 回首之后连接不出来 图片里是我的连接体系 不知道为什么 若你能帮我分析出问题在哪里 我请你吃好多好多果冻

QQ图片 连接体系.jpg
...

字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。

不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。

150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。

“回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了，

1，载体双酶切，
如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。

2，片段酶切，
片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。

3，连接，
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。
如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。

大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~
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冰扣儿
21楼2015-09-11 19:33:24
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样 ...

大神果然是大神，一句话省去我好多工作量，就这个电泳图胶回收我会收到凌晨两点多。我刚进实验室，之前没有师兄师姐做过这方面，现在老师让我建立这个平台体系，可否请教大神扣扣号？以后还希望大神多多指点！你喜欢吃什么牌子什么口味的果冻？地址？我正要去超市。
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优秀，是一种习惯！
22楼2015-09-12 14:15:59
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

内容已删除
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23楼2015-09-13 13:47:40
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

遇到过，我的质粒也是大约7kbp，跑出来是15K+。切下来继续做吧，如果是富集，是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克，量就足够了。连接连不上是不是黏性啊，我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入的DNA片段大小多少，再加1微升水吧，总体积是10，感觉会好一些。
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24楼2015-09-13 15:20:59
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-13 13:47:40


果冻留着吧，MM做实验不要熬太晚，学会自主学习，寻求帮助，祝实验顺利。...

果冻已经买好了，给你寄过去吧，我说过请你吃了，君子一言驷马难追！而且，我有工资，平时花不完，哈哈。已经连接上了，看了很多帖子，自己最后重设了体系，还没送去测序，但是转化效果还不错。多谢指点！
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25楼2015-09-14 11:54:23
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 沉默的独角兽 at 2015-09-13 15:20:59
遇到过，我的质粒也是大约7kbp，跑出来是15K+。切下来继续做吧，如果是富集，是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克，量就足够了。连接连不上是不是黏性啊，我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入 ...

多谢！已经连上了，最后重设了体系，根据这个公式连计算片段和载体分别需要的量。公式是：插入片段体积(μl) = T载体量(ng)x 插入片段大小(kb)÷T载体大小(kb)x插入片段与T载体的摩尔比(3~10:1) ÷ 插入片段浓度(ng/μl)。载体与片段相差不大一般用5:1，大的话就用8:1.
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优秀，是一种习惯！
26楼2015-09-14 11:59:14
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冰扣儿

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样 ...

我把你的金玉良言粘贴到word打印出来了 哈哈
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优秀，是一种习惯！
27楼2015-09-14 12:02:12
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