应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 质粒跑出这样的电泳图可以割胶回收吗？
273/3返回列表上一页123
查看: 3293  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 冰扣儿 at 2015-09-11 14:21:21
谢谢指点 因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 回首之后连接不出来 图片里是我的连接体系 不知道为什么 若你能帮我分析出问题在哪里 我请你吃好多好多果冻

QQ图片 连接体系.jpg
...

字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样等于增加了胶体积，降低了回收时DNA的浓度。对于柱纯化而言，吸附效率与DNA浓度关系很大，越是浓度低越是损失大。你完全可以把所有的样品放在一个合适的孔里面，切的时候争取小点。

不过话说回来，一般而言还不至于低到影响连接，所以你这里或许还会有其他问题。

150 ng质粒用于连接，对于一般的片段而言足够了，除非你片段很长，这时候就得计算一下了，一般而言片段需要过量一点。

“回首之后连接不出来”，这个事情原因就很多了。为了有逻辑一点，我这样说好了，

1，载体双酶切，
如果是空载，掉下来的片段不到80bp以下的，完全可以直接过柱回收，没必要跑胶分离，现在绝大多数公司的内切酶，在10倍过量的情况下是可以很好工作的。双酶切，一般也不需要脱磷，脱磷对于单酶切而言一般情况下必要，但是对于双酶切，其实可以不做，不做的好处就是反而还可以提高连接效率。因为脱磷缺掉的磷酸是需要细胞修复的。

2，片段酶切，
片段，即便加上保护碱基，酶切效率相对于质粒往往也是低的。对于PCR得到的片段而言，摩尔数也一般很高，所以酶切经常不彻底，可以稍微多切一会，取决于你用的酶，特别是考虑星号活性。

3，连接，
必须带上不含插入片段只有载体的对照。
一般而言，只要是克隆熟相对于对照有明显区别，都非常有可能拿到阳性克隆，不是说一定要对照少片段多，经常会对照多片段少。我曾经图省事设计过一种克隆，直接单酶切平末端的载体，不脱磷连接PCR产物，PCR产物两头没有磷，全靠载体连，那结果就是对照密密麻麻，连接零星几个，这样就对了。
如果连接没长，这时候一定要关注一下对照，如果对照也一个没长，不是说载体做得太好了，而是好过了头，这时候要减少双酶切时间，不要脱磷，增大载体连接量再试。

大多数而言，以上分析能够解决问题，等待你的果冻！~
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

冰扣儿
21楼2015-09-11 19:33:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样 ...

大神果然是大神，一句话省去我好多工作量，就这个电泳图胶回收我会收到凌晨两点多。我刚进实验室，之前没有师兄师姐做过这方面，现在老师让我建立这个平台体系，可否请教大神扣扣号？以后还希望大神多多指点！你喜欢吃什么牌子什么口味的果冻？地址？我正要去超市。
赞一下 回复此楼
优秀，是一种习惯！
22楼2015-09-12 14:15:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

内容已删除
赞一下 回复此楼
23楼2015-09-13 13:47:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

遇到过，我的质粒也是大约7kbp，跑出来是15K+。切下来继续做吧，如果是富集，是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克，量就足够了。连接连不上是不是黏性啊，我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入的DNA片段大小多少，再加1微升水吧，总体积是10，感觉会好一些。
赞一下 回复此楼
24楼2015-09-13 15:20:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-13 13:47:40


果冻留着吧，MM做实验不要熬太晚，学会自主学习，寻求帮助，祝实验顺利。...

果冻已经买好了，给你寄过去吧，我说过请你吃了，君子一言驷马难追！而且，我有工资，平时花不完，哈哈。已经连接上了，看了很多帖子，自己最后重设了体系，还没送去测序，但是转化效果还不错。多谢指点！
赞一下 回复此楼
优秀，是一种习惯！
25楼2015-09-14 11:54:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰扣儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 沉默的独角兽 at 2015-09-13 15:20:59
遇到过，我的质粒也是大约7kbp，跑出来是15K+。切下来继续做吧，如果是富集，是所有的胶溶掉后过 同一个柱子吧。我一般就切1微克，量就足够了。连接连不上是不是黏性啊，我最近做的黏性末端就不好连。此外体系中插入 ...

多谢！已经连上了，最后重设了体系，根据这个公式连计算片段和载体分别需要的量。公式是：插入片段体积(μl) = T载体量(ng)x 插入片段大小(kb)÷T载体大小(kb)x插入片段与T载体的摩尔比(3~10:1) ÷ 插入片段浓度(ng/μl)。载体与片段相差不大一般用5:1，大的话就用8:1.
赞一下 回复此楼
优秀，是一种习惯！
26楼2015-09-14 11:59:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰扣儿

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-11 19:33:24
字挺漂亮嘛！~哇哈哈哈，好吧，多说几句！

“因为回收效率低 所以想多跑几个孔富集到一个柱子上 ”

这句话不符合逻辑，若是效率低，愈发要减少体积，你这么多孔，孔和孔之间的缝隙还会去一个一个切走么？这样 ...

我把你的金玉良言粘贴到word打印出来了 哈哈
赞一下 回复此楼
优秀，是一种习惯！
27楼2015-09-14 12:02:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 冰扣儿 的主题更新
273/3返回列表上一页123
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 293求调剂 +5 加一一九 2026-03-24 5/250 2026-03-24 11:54 by syl20081243
[考研] 求调剂 +5 研研，接电话 2026-03-24 6/300 2026-03-24 11:39 by 星空星月
[考研] 一志愿河北工业大学0817化工278分求调剂 +7 jhybd 2026-03-23 12/600 2026-03-24 09:03 by jhybd
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +9 材料学257求调剂 2026-03-23 10/500 2026-03-24 07:36 by wangy0907
[考研] 284求调剂 +10 Zhao anqi 2026-03-22 10/500 2026-03-24 00:08 by Equinoxhua
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 327求调剂 +5 prayer13 2026-03-23 5/250 2026-03-23 22:11 by 星空星月
[考研] 考研化学308分求调剂 +7 你好明天你好 2026-03-23 8/400 2026-03-23 18:39 by macy2011
[考研] 291 求调剂 +4 化工2026届毕业� 2026-03-21 5/250 2026-03-23 16:46 by 化工2026届毕业�
[考研] 316求调剂 +7 梁茜雯 2026-03-19 7/350 2026-03-23 16:21 by lingjue
[考研] 0854电子信息求调剂 +3 α____ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:28 by zhq0425
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +5 我爱生物生物爱� 2026-03-17 5/250 2026-03-22 16:42 by tcx007
[考研] 0703化学297求调剂 +3 Daisy☆ 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:45 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 304求调剂 +7 司空. 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:08 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +9 Doleres 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:36 by JourneyLucky
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +4 @taotao 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:14 by JourneyLucky
[考研] 0856调剂，是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
[考研] 生物学调剂招人！！！ +3 山海天岚 2026-03-17 4/200 2026-03-19 21:34 by 怎么释怀
[考研] 0703化学调剂 +4 18889395102 2026-03-18 4/200 2026-03-19 16:13 by 30660438
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭