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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 抗菌实验96孔板测MIC问题
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zc980735353

铁虫 (初入文坛)

[求助] 抗菌实验96孔板测MIC问题 已有1人参与

大家好，最近我做了4种菌（MRSA 大肠 金葡 沙门），96孔板培养了18小时左右，测OD时所有的孔数据都是一样的，都没有长菌（包括空白菌液对照），（菌液稀释了10的5次方，LB培养基，）不知道是哪里出了问题？还望指导，（最好有详细的步骤）谢谢
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1楼 2015-09-08 17:22:17
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smilingworld

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主说的在96孔板培养了18个小时是什么？只是让10的5次方的菌单纯的培养在96孔板里，没有加抗生素稀释液么？
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2楼2015-09-09 09:51:23
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zc980735353

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by smilingworld at 2015-09-09 09:51:23
楼主说的在96孔板培养了18个小时是什么？只是让10的5次方的菌单纯的培养在96孔板里，没有加抗生素稀释液么？

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养，挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液，37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml )。分别将有抑菌活性的待测拟拟肽溶液按2倍连续稀释后加入96孔微量培养板中，除第1孔加入稀释菌液90μl外，2-10各孔均加入50μl，继于第1孔加入抗菌拟肽原液(浓度1024 μg/ml ) 10μl，混合后吸出50μl加入第2孔中，依次稀释至第9孔，弃去50μL。
第10孔生长对照，第11孔LB培养液50μl空白对照，第12孔为阳性对照(庆大霉素)加90μl菌液和10μl同浓度抗生素溶液混合后弃50μl。37 ℃培养18h后，用ELISA酶标仪分别在490/520/600/620nm下对平板进行扫描
我是按照这个步骤做的，测OD值所有数据都是一样的，就是没长菌，不知道是什么问题。
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3楼2015-09-09 15:57:14
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smilingworld

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-09 15:57:14
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养，挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液，37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml  ...

楼主所检测的最高抗菌拟肽的浓度是102.4μg/ml，然后依次2倍稀释对吧？你在培养18个小时之前有没有测OD？还有18个小时可能时间有点短，我做的MIC时，在37度环境培养了3天左右，才有孔变浑浊。还有一点37度保存的时候，一定要密封好96孔板，不然里面的水分会蒸发，多少影响最后结果
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4楼2015-09-09 17:27:30
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zc980735353

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by smilingworld at 2015-09-09 17:27:30
楼主所检测的最高抗菌拟肽的浓度是102.4μg/ml，然后依次2倍稀释对吧？你在培养18个小时之前有没有测OD？还有18个小时可能时间有点短，我做的MIC时，在37度环境培养了3天左右，才有孔变浑浊。还有一点37度保存的时 ...

还有我做的时候是加的稀释好的菌液和药液，需要加培养基吗？我怀疑是不是没加培养基所以没长？
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5楼2015-09-10 09:11:39
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smilingworld

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-10 09:11:39
还有我做的时候是加的稀释好的菌液和药液，需要加培养基吗？我怀疑是不是没加培养基所以没长？...

楼主说加新鲜培养基？跟加培养基没有关系，加了培养基药液菌液浓度反而降低，结果不准确
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6楼2015-09-10 09:28:00
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芳芳芳。

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2016-12-02 09:13:20
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gmyankitty

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-09 15:57:14
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养，挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液，37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml  ...

首先，应该在样品稀释好后最后统一加菌液，你的步骤中先把菌液加进去再加抑菌成分，对于浓度高的已经把菌杀死部分，导致每一空所加菌浓度是不一样的。
另外每孔中都应有培养基原液，即未被稀释过的。
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8楼2016-12-02 09:26:09
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少女swag

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-10 09:11:39
还有我做的时候是加的稀释好的菌液和药液，需要加培养基吗？我怀疑是不是没加培养基所以没长？...

你好，请问这个问题最后是怎么解决的，我现在也是这个问题
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9楼2022-05-03 13:55:02
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