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zc980735353

铁虫 (初入文坛)

[求助] 抗菌实验96孔板测MIC问题 已有1人参与

大家好,最近我做了4种菌(MRSA 大肠 金葡 沙门),96孔板培养了18小时左右,测OD时所有的孔数据都是一样的,都没有长菌(包括空白菌液对照),(菌液稀释了10的5次方,LB培养基,)不知道是哪里出了问题?还望指导,(最好有详细的步骤)谢谢
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gmyankitty

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-09 15:57:14
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养,挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液,37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml  ...

首先,应该在样品稀释好后最后统一加菌液,你的步骤中先把菌液加进去再加抑菌成分,对于浓度高的已经把菌杀死部分,导致每一空所加菌浓度是不一样的。
另外每孔中都应有培养基原液,即未被稀释过的。
8楼2016-12-02 09:26:09
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smilingworld

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主说的在96孔板培养了18个小时是什么?只是让10的5次方的菌单纯的培养在96孔板里,没有加抗生素稀释液么?
2楼2015-09-09 09:51:23
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zc980735353

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by smilingworld at 2015-09-09 09:51:23
楼主说的在96孔板培养了18个小时是什么?只是让10的5次方的菌单纯的培养在96孔板里,没有加抗生素稀释液么?

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养,挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液,37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml )。分别将有抑菌活性的待测拟拟肽溶液按2倍连续稀释后加入96孔微量培养板中,除第1孔加入稀释菌液90μl外,2-10各孔均加入50μl,继于第1孔加入抗菌拟肽原液(浓度1024 μg/ml ) 10μl,混合后吸出50μl加入第2孔中,依次稀释至第9孔,弃去50μL。
第10孔生长对照,第11孔LB培养液50μl空白对照,第12孔为阳性对照(庆大霉素)加90μl菌液和10μl同浓度抗生素溶液混合后弃50μl。37 ℃培养18h后,用ELISA酶标仪分别在490/520/600/620nm下对平板进行扫描
我是按照这个步骤做的,测OD值所有数据都是一样的,就是没长菌,不知道是什么问题。
3楼2015-09-09 15:57:14
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smilingworld

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zc980735353 at 2015-09-09 15:57:14
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌、枯草芽孢杆菌在灭菌LB培养基平板上过夜培养,挑取单菌落接种于灭菌锥形瓶的LB培养液,37℃170 r/min过夜培养。将培养后的菌液作1:1000稀释(使菌数达到105~106cfu/ml  ...

楼主所检测的最高抗菌拟肽的浓度是102.4μg/ml,然后依次2倍稀释对吧?你在培养18个小时之前有没有测OD?还有18个小时可能时间有点短,我做的MIC时,在37度环境培养了3天左右,才有孔变浑浊。还有一点37度保存的时候,一定要密封好96孔板,不然里面的水分会蒸发,多少影响最后结果
4楼2015-09-09 17:27:30
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