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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做细菌的荧光定量PCR，SYBR GREEN I 染料，提取的是DNA，选择什么内参比较好？
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runye2015

新虫 (小有名气)

[交流] 做细菌的荧光定量PCR，SYBR GREEN I 染料，提取的是DNA，选择什么内参比较好？

如题，GAPDH，β-actin 还是18s rRNA？这些内参可以买到吗？谢谢！
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1楼 2015-09-08 17:14:15
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runye2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我不是小郭 at 2015-09-10 16:17:36
根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCR，先以CT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析 ...

嗯～学习了！！非常谢谢！！

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13楼2015-09-11 23:25:17
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普通回帖

xiaochong8693

木虫之王 (文坛精英)
祝福楼主啊！
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2楼2015-09-08 17:40:58
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runye2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaochong8693 at 2015-09-08 17:40:58
祝福楼主啊！

嗯～谢谢！

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3楼2015-09-08 18:49:16
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王平阳

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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runye2015: 金币+3 2015-09-08 22:06:36
用DNA做定量？这个。。。什么目的啊？如果是基因组DNA作为模板定量，那么你说的几种都不能用，那是cDNA做模板定量的内参，没听说过用基因组DNA为模板的定量，建议你还是想想你这样做的目的是什么。
不好意思没帮到你
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没有做不到，只有想不到！
4楼2015-09-08 20:40:27
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runye2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-09-08 20:40:27
用DNA做定量？这个。。。什么目的啊？如果是基因组DNA作为模板定量，那么你说的几种都不能用，那是cDNA做模板定量的内参，没听说过用基因组DNA为模板的定量，建议你还是想想你这样做的目的是什么。
不好意思没帮到 ...

我的实验是对几种细菌进行定量，提取的是总的DNA,然后这几种细菌的设计引物，再进行荧光定量，半定量，之前在网上查的是绝对定量通过标准曲线进行精确定量～半定量通过内参，现在不知道内参用什么～～谢谢您的回复！

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5楼2015-09-08 22:04:21
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hutingting

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
runye2015: 金币+6 2015-09-10 12:50:35
我做过，测各个菌株的RNA水平，逆转录之后cDNA为模板，16S做内参的，引物序列文献里有，去合成一对就是了
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6楼2015-09-10 11:40:37
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runye2015

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hutingting at 2015-09-10 11:40:37
我做过，测各个菌株的RNA水平，逆转录之后cDNA为模板，16S做内参的，引物序列文献里有，去合成一对就是了

非常感谢您的回复！
我的实验是在总的DNA里检测三种细菌，已经设计了引物，这个引物可以用吗？～
意思是用cDNA和引物反应得到的目的片段为内参吗？～～这方面不是特别了解～谢谢！

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7楼2015-09-10 12:54:53
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hutingting

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by runye2015 at 2015-09-10 12:54:53
非常感谢您的回复！
我的实验是在总的DNA里检测三种细菌，已经设计了引物，这个引物可以用吗？～
意思是用cDNA和引物反应得到的目的片段为内参吗？～～这方面不是特别了解～谢谢！
...

不太明白你的实验目的是什么？是鉴定细菌种类？还是检测三种细菌中哪一种中某个基因的表达量高低？我的实验是检测不同菌株中某一基因的mRNA水平的高低，所以提取总RNA，oligo dT引物逆转录成cDNA，以一株细菌检测为例，cDNA为模板，一管realtime pcr反应中加入目的基因扩增引物，对照则是另一管realtimepcr反应中加入16S引物，确定这两对扩增效率都在100%的前提下，通过CT值之比，得出各株之间相对mRNA水平
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8楼2015-09-10 13:59:05
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hutingting

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by runye2015 at 2015-09-10 12:54:53
非常感谢您的回复！
我的实验是在总的DNA里检测三种细菌，已经设计了引物，这个引物可以用吗？～
意思是用cDNA和引物反应得到的目的片段为内参吗？～～这方面不是特别了解～谢谢！
...

另外我们检测真核细胞某基因的DNA水平，是提取基因组DNA，以GAPDH为内参的，用的是绝对定量测拷贝数，细菌中有的基因在基因组是单拷贝的，具体情况具体对待吧，可以找几篇文献看看
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9楼2015-09-10 14:03:56
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我不是小郭

木虫 (小有名气)

此人有毒
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCR，先以CT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。
      也可用geNorm内参分析软件来选择合适的内参基因。
      对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。
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实践是检验真理的唯一标准
10楼2015-09-10 16:17:36
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