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runye2015

新虫 (小有名气)

[交流] 做细菌的荧光定量PCR,SYBR GREEN I 染料,提取的是DNA,选择什么内参比较好?

如题,GAPDH,β-actin 还是18s rRNA?这些内参可以买到吗?谢谢!
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hutingting

银虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
runye2015: 金币+6 2015-09-10 12:50:35
我做过,测各个菌株的RNA水平,逆转录之后cDNA为模板,16S做内参的,引物序列文献里有,去合成一对就是了
6楼2015-09-10 11:40:37
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hutingting

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by runye2015 at 2015-09-10 12:54:53
非常感谢您的回复!
我的实验是在总的DNA里检测三种细菌,已经设计了引物,这个引物可以用吗?~
意思是用cDNA和引物反应得到的目的片段为内参吗?~~这方面不是特别了解~谢谢!
...

不太明白你的实验目的是什么?是鉴定细菌种类?还是检测三种细菌中哪一种中某个基因的表达量高低?我的实验是检测不同菌株中某一基因的mRNA水平的高低,所以提取总RNA,oligo dT引物逆转录成cDNA,以一株细菌检测为例,cDNA为模板,一管realtime pcr反应中加入目的基因扩增引物,对照则是另一管realtimepcr反应中加入16S引物,确定这两对扩增效率都在100%的前提下,通过CT值之比,得出各株之间相对mRNA水平
8楼2015-09-10 13:59:05
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hutingting

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by runye2015 at 2015-09-10 12:54:53
非常感谢您的回复!
我的实验是在总的DNA里检测三种细菌,已经设计了引物,这个引物可以用吗?~
意思是用cDNA和引物反应得到的目的片段为内参吗?~~这方面不是特别了解~谢谢!
...

另外我们检测真核细胞某基因的DNA水平,是提取基因组DNA,以GAPDH为内参的,用的是绝对定量测拷贝数,细菌中有的基因在基因组是单拷贝的,具体情况具体对待吧,可以找几篇文献看看
9楼2015-09-10 14:03:56
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