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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？
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18734780938

铁虫 (初入文坛)

[求助] pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？ 已有8人参与

从全基因组中pcr一段15k的片段，始终不能获得目的条带。试过了各种酶，优化了条件，试过增加镁离子浓度，最后用Ex-taq只能够获得8000bp以上的弥散条带，不知道该怎么办？求高人帮助，不胜感激！
50ul体系：Ex-taq 0.25
               Buffer 10* 5
              dNTP(0.25) 4
             模板引物各1
             Mgcl2  0.6
pcr 条件：98 30s
                 98 10s
                55 30s
               72 30min
              72  7min
进行了10个cycles
结果如下：
第一张是0.6、 0.8ul的Mgcl2
第二张是以上两管胶回收以后作为模版相同条件重新pcr后的结果

pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？
1.png


pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？-1
2.png
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1楼 2015-08-31 11:10:45
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
15k太长了，你每个循环的延伸时间都30分钟了，那整个PCR不是要跑一整天？很可能头几个循环模板都已经降解了
建议你用比较强大的高保真酶，有些像phusion的又快又准，不过也比较贵
15k的难度真的挺大，祝你好运
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2楼2015-08-31 12:02:25
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普通回帖

hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议用KOD  DNA聚合酶，它的速率比较快，一分钟2KB。还有可以尝试分段扩，在连起来，当然我没试过。祝好运。
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3楼2015-08-31 13:03:29
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模版质量要高，另外扩增酶质量要好，最好加点扩增增强因子

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4楼2015-08-31 13:32:08
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
15kb是简单模板还是基因组模板啊，一般的热启动Taq酶已经算不错了能扩增10kb以下的，15kb的话长片段酶就能达到要求了，要注意优化buffer等条件，看看这篇资料吧 http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html 关于扩增选择，应该对你有用吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-09-01 10:00:52
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枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Taq酶一般没有那么长时间的活性，换酶吧，flypfu、PrimeSTAR Max试一试，应该就没有问题了
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6楼2015-09-01 14:04:08
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18734780938

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-01 14:04:08
Taq酶一般没有那么长时间的活性，换酶吧，flypfu、PrimeSTAR Max试一试，应该就没有问题了

都试过了，毫无用处。所有的酶只有Ex-Taq能够p出弥散的东西，其他的酶只有引物二聚体啊。。。。。。
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7楼2015-09-02 09:12:12
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18734780938

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biosci at 2015-08-31 13:32:08
模版质量要高，另外扩增酶质量要好，最好加点扩增增强因子

什么是扩增增强子？
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8楼2015-09-02 09:13:14
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791945301

新虫 (初入文坛)
加5%体积的DMSO,甜菜碱。选用大片段高保真酶。用低于1%的琼脂糖胶试试。

发自小木虫Android客户端
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9楼2015-09-02 10:57:53
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枭翔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18734780938 at 2015-09-02 09:12:12
都试过了，毫无用处。所有的酶只有Ex-Taq能够p出弥散的东西，其他的酶只有引物二聚体啊。。。。。。...

重新检查你设计的引物，然后扩增的时候，体系加上5-10%的DMSO。
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10楼2015-09-02 13:35:26
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