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18734780938

铁虫 (初入文坛)

[求助] pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带? 已有8人参与

从全基因组中pcr一段15k的片段,始终不能获得目的条带。试过了各种酶,优化了条件,试过增加镁离子浓度,最后用Ex-taq只能够获得8000bp以上的弥散条带,不知道该怎么办?求高人帮助,不胜感激!
50ul体系:Ex-taq 0.25
               Buffer 10* 5
              dNTP(0.25) 4
             模板引物各1
             Mgcl2  0.6
pcr 条件:98 30s
                 98 10s
                55 30s
               72 30min
              72  7min
进行了10个cycles
结果如下:
第一张是0.6、 0.8ul的Mgcl2
第二张是以上两管胶回收以后作为模版相同条件重新pcr后的结果

pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带?
1.png


pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带?-1
2.png
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791945301

新虫 (初入文坛)

加5%体积的DMSO,甜菜碱。选用大片段高保真酶。用低于1%的琼脂糖胶试试。

发自小木虫Android客户端
9楼2015-09-02 10:57:53
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查看全部 14 个回答

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
15k太长了,你每个循环的延伸时间都30分钟了,那整个PCR不是要跑一整天?很可能头几个循环模板都已经降解了
建议你用比较强大的高保真酶,有些像phusion的又快又准,不过也比较贵
15k的难度真的挺大,祝你好运
2楼2015-08-31 12:02:25
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议用KOD  DNA聚合酶,它的速率比较快,一分钟2KB。还有可以尝试分段扩,在连起来,当然我没试过。祝好运。
3楼2015-08-31 13:03:29
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模版质量要高,另外扩增酶质量要好,最好加点扩增增强因子

发自小木虫Android客户端
4楼2015-08-31 13:32:08
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