应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？
141/2返回列表12下一页
查看: 1333  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

18734780938

铁虫 (初入文坛)

[求助] pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？ 已有8人参与

从全基因组中pcr一段15k的片段，始终不能获得目的条带。试过了各种酶，优化了条件，试过增加镁离子浓度，最后用Ex-taq只能够获得8000bp以上的弥散条带，不知道该怎么办？求高人帮助，不胜感激！
50ul体系：Ex-taq 0.25
               Buffer 10* 5
              dNTP(0.25) 4
             模板引物各1
             Mgcl2  0.6
pcr 条件：98 30s
                 98 10s
                55 30s
               72 30min
              72  7min
进行了10个cycles
结果如下：
第一张是0.6、 0.8ul的Mgcl2
第二张是以上两管胶回收以后作为模版相同条件重新pcr后的结果

pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？
1.png


pcr怎样才能扩出15k以上的目的条带？-1
2.png
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-08-31 11:10:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
15k太长了，你每个循环的延伸时间都30分钟了，那整个PCR不是要跑一整天？很可能头几个循环模板都已经降解了
建议你用比较强大的高保真酶，有些像phusion的又快又准，不过也比较贵
15k的难度真的挺大，祝你好运
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-08-31 12:02:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议用KOD  DNA聚合酶，它的速率比较快，一分钟2KB。还有可以尝试分段扩，在连起来，当然我没试过。祝好运。
赞一下 回复此楼
3楼2015-08-31 13:03:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模版质量要高，另外扩增酶质量要好，最好加点扩增增强因子

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-31 13:32:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
15kb是简单模板还是基因组模板啊，一般的热启动Taq酶已经算不错了能扩增10kb以下的，15kb的话长片段酶就能达到要求了，要注意优化buffer等条件，看看这篇资料吧 http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html 关于扩增选择，应该对你有用吧
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-09-01 10:00:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Taq酶一般没有那么长时间的活性，换酶吧，flypfu、PrimeSTAR Max试一试，应该就没有问题了
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-01 14:04:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18734780938

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-01 14:04:08
Taq酶一般没有那么长时间的活性，换酶吧，flypfu、PrimeSTAR Max试一试，应该就没有问题了

都试过了，毫无用处。所有的酶只有Ex-Taq能够p出弥散的东西，其他的酶只有引物二聚体啊。。。。。。
赞一下 回复此楼
7楼2015-09-02 09:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18734780938

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biosci at 2015-08-31 13:32:08
模版质量要高，另外扩增酶质量要好，最好加点扩增增强因子

什么是扩增增强子？
赞一下 回复此楼
8楼2015-09-02 09:13:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

791945301

新虫 (初入文坛)
加5%体积的DMSO,甜菜碱。选用大片段高保真酶。用低于1%的琼脂糖胶试试。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-02 10:57:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枭翔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18734780938 at 2015-09-02 09:12:12
都试过了，毫无用处。所有的酶只有Ex-Taq能够p出弥散的东西，其他的酶只有引物二聚体啊。。。。。。...

重新检查你设计的引物，然后扩增的时候，体系加上5-10%的DMSO。
赞一下 回复此楼
10楼2015-09-02 13:35:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 18734780938 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 265求调剂 +13 梁梁校校 2026-03-19 15/750 2026-03-26 16:21 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿华理，数一英一285求A区调剂 +4 AZMK 2026-03-25 6/300 2026-03-26 16:12 by 王小欠i
[考研] 调剂310 +3 温柔的晚安 2026-03-25 4/200 2026-03-25 23:16 by peike
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +6 jiajunX 2026-03-22 6/300 2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 材料与化工 322求调剂 +6 然11 2026-03-19 6/300 2026-03-25 18:37 by haxia
[考研] 网络空间安全0839招调剂 +4 w320357296 2026-03-25 6/300 2026-03-25 17:59 by 255671
[考研] 296求调剂 +4 汪！？！ 2026-03-25 7/350 2026-03-25 16:41 by 汪！？！
[考研] 求调剂323材料与化工 +4 1124361 2026-03-24 4/200 2026-03-25 11:19 by shulmg
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +4 13831862839 2026-03-24 5/250 2026-03-25 09:47 by 无际的草原
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 318求调剂 +5 plum李子 2026-03-21 8/400 2026-03-25 09:26 by aa331100
[考研] 求调剂 +5 林之夕 2026-03-24 5/250 2026-03-24 17:16 by dick_runner
[考研] 求调剂 +6 研研，接电话 2026-03-24 7/350 2026-03-24 17:01 by barlinike
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭