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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 扩增GC含量高的片段
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胡啊胡

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩增GC含量高的片段 已有7人参与

本人新手，最近扩增一段500 bp的片段，GC含量70％，用了GC buffer 但是条带很弱，达不到测序标准，求助各位大神？这种情况该怎么办？

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1楼 2015-08-29 11:16:44
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能上电泳图片么？我最近也在克隆gc含量高达80%的片段。

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2楼2015-08-29 18:26:20
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迷迭的微笑

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-29 22:55:41
你是用普通的TAKA酶还是专用于GC含量较高的酶，是从总DNA上还是质粒上，GC buffer也有很多，你用的是哪个公司的，这些都有影响。你得具体说说
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3楼2015-08-29 20:27:11
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胡啊胡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 迷迭的微笑 at 2015-08-29 20:27:11
你是用普通的TAKA酶还是专用于GC含量较高的酶，是从总DNA上还是质粒上，GC buffer也有很多，你用的是哪个公司的，这些都有影响。你得具体说说

是总DNA,TAKARA的rTaq酶和GC buffer

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4楼2015-08-31 00:03:31
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acvhreinlg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的PCR条件什么的没写清楚，不知道你的退火温度多少，GC含量高退火温度要提高，我曾经做过GC含量高达85%的，GC buffer是关键，退火温度也很重要

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科研是将金钱转换为知识的过程，而创新则是将知识转换为金钱的过程。
5楼2015-09-01 06:13:25
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coelicolor

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加DMSO。一般25微升加2微升、最高加到4。链霉菌GC就在70%以上。没用过GCbuffer。就KODplus或者2*Taq Mix.退火做梯度吧，56-70。

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要有最遥远的梦想
6楼2015-09-01 08:34:30
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胡啊胡

新虫 (初入文坛)
这个是我试的温度条件，选用了62度，但是还是没达到右边的那种亮度，还能怎么改善条件呢？
扩增GC含量高的片段



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7楼2015-09-01 14:37:45
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

在体系里加1%-4%的DMSO试试。
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8楼2015-09-01 15:09:20
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791945301

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

加5%至10%的DMSO

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9楼2015-09-01 19:55:28
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clive931

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以在其上下游稍远一点地方先克隆出一段比较好克隆的片段 纯化以后作为模板再克隆目的片段。 楼主可以搜索一下巢式pcr。看看相关方法和原理。

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10楼2015-09-01 21:36:47
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