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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qRT-PCR引物设计
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无语。。。

铜虫 (初入文坛)

[求助] qRT-PCR引物设计

新手求助各位前辈~~
只有一个基因的部分基因组序列，没有cDNA序列，可以根据这部分基因组序列设计qRT-PCR引物吗？好像通常引物是要跨内含子，通过软件预测内含子后再设计引物可以吗？会不会效果不好？
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1楼 2015-08-27 17:26:48
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无语。。。: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-08-27 21:28:51
这个难度好像比较大。

也没有说必须跨内含子，不过有跨内含子的引物只会扩增mRNA不会扩增可能混在样本里面的DNA

也就是说，如果你的RNA提纯做得很好，没有太多DNA污染的话，引物不跨内含子也影响不大

至于用软件预测内含子，我真没有做过。有可能推测错了就根本做不出来PCR。不过如果资金允许，软件又靠谱的话，大可以多试试几个引物。问题就是假如某个位置原本没有内含子的，你的软件说有，然后你据此设计的引物又能够扩增出产物，到头来你也不知道它究竟是不是跨内含子了。
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2楼2015-08-27 18:21:00
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无语。。。: 金币+5, ★有帮助 2015-08-27 21:29:19
理论上可行，但是不试怎么知道效果到底如何。先预测内含子、外显子，然后再参考同源基因的序列，设计跨内含子引物，实验验证。
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3楼2015-08-27 18:21:17
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无语。。。: 金币+7, ★★★很有帮助 2015-08-27 21:30:02
建议你可以找一下该基因在其他测序物种中的序列，比对一下找一下外显子和内含子的位置。用软件分析后可以相互验证。再一个你根据预测的外显子中间位置设计对引物在cDNA上扩增一下测序，不就清楚外显子的末端序列位置。
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hehe
4楼2015-08-27 20:19:23
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无语。。。

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-27 18:21:17
理论上可行，但是不试怎么知道效果到底如何。先预测内含子、外显子，然后再参考同源基因的序列，设计跨内含子引物，实验验证。

恩啊~人太懒~就来请教下前辈们有没有这样经验的嘛~
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5楼2015-08-27 21:21:58
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无语。。。

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-27 18:21:00
这个难度好像比较大。

也没有说必须跨内含子，不过有跨内含子的引物只会扩增mRNA不会扩增可能混在样本里面的DNA

也就是说，如果你的RNA提纯做得很好，没有太多DNA污染的话，引物不跨内含子也影响不大

至于 ...

恩啊~多谢~
所以我觉得还是知道cDNA序列后再设计引物比较靠谱~~
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6楼2015-08-27 21:23:50
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无语。。。

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-27 20:19:23
建议你可以找一下该基因在其他测序物种中的序列，比对一下找一下外显子和内含子的位置。用软件分析后可以相互验证。再一个你根据预测的外显子中间位置设计对引物在cDNA上扩增一下测序，不就清楚外显子的末端序列位置 ...

这个基因在其他物种里面有，但是相似度不高，所以估计比对起来找也不是很准。
现在看来还是要先获取cDNA序列了~~谢啦~
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7楼2015-08-27 21:27:46
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