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无语。。。

铜虫 (初入文坛)

[求助] qRT-PCR引物设计

新手求助各位前辈~~
只有一个基因的部分基因组序列,没有cDNA序列,可以根据这部分基因组序列设计qRT-PCR引物吗?好像通常引物是要跨内含子,通过软件预测内含子后再设计引物可以吗?会不会效果不好?
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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无语。。。: 金币+5, 有帮助 2015-08-27 21:29:19
理论上可行,但是不试怎么知道效果到底如何。先预测内含子、外显子,然后再参考同源基因的序列,设计跨内含子引物,实验验证。
3楼2015-08-27 18:21:17
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查看全部 7 个回答

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
无语。。。: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-08-27 21:28:51
这个难度好像比较大。

也没有说必须跨内含子,不过有跨内含子的引物只会扩增mRNA不会扩增可能混在样本里面的DNA

也就是说,如果你的RNA提纯做得很好,没有太多DNA污染的话,引物不跨内含子也影响不大

至于用软件预测内含子,我真没有做过。有可能推测错了就根本做不出来PCR。不过如果资金允许,软件又靠谱的话,大可以多试试几个引物。问题就是假如某个位置原本没有内含子的,你的软件说有,然后你据此设计的引物又能够扩增出产物,到头来你也不知道它究竟是不是跨内含子了。
2楼2015-08-27 18:21:00
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
无语。。。: 金币+7, ★★★很有帮助 2015-08-27 21:30:02
建议你可以找一下该基因在其他测序物种中的序列,比对一下找一下外显子和内含子的位置。用软件分析后可以相互验证。再一个你根据预测的外显子中间位置设计对引物在cDNA上扩增一下测序,不就清楚外显子的末端序列位置。
hehe
4楼2015-08-27 20:19:23
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无语。。。

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-27 18:21:17
理论上可行,但是不试怎么知道效果到底如何。先预测内含子、外显子,然后再参考同源基因的序列,设计跨内含子引物,实验验证。

恩啊~人太懒~就来请教下前辈们有没有这样经验的嘛~
5楼2015-08-27 21:21:58
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