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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求蛋白表达大侠指点
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小糖精

铜虫 (小有名气)

[求助] 求蛋白表达大侠指点 已有4人参与

我做蛋白表达，共有两条带，一条是目的条带，大约21KD左右，另一条要比目的条带粗很多，大约60KD左右，我不知道是不是形成了三聚体，想请教一下有什么方法可以鉴别一下？望各位大侠指点！这两条带是挂了Ni柱纯化下来的。
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1楼 2015-08-17 10:52:18
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小糖精: 金币+5 2015-08-22 10:40:42
你的三聚体会带组氨酸吗？如果聚合后会有，你可以用还原SDS再做一下，如果有条带打开，SDS会有反应的。
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2楼2015-08-17 15:43:59
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苏先森

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小糖精: 金币+5 2015-08-22 10:40:49
Loading buffer分别用还原和非还原，看是否有区别。如果没有区别，应该是杂带；如果60kd条带没了或减弱，应该是聚体。ps）二聚体比较常见，另外最好上图，方便查看。
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Number 7
3楼2015-08-17 15:58:27
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小糖精: 金币+5 2015-08-22 10:40:53
可以加0.5-1mM DTT,或者5-10mM β-ME打开下看看不就知道了么，注意蛋白表达纯化实验时的PH要大于7效果才明显，上NI柱前一定要把游离的NI冲干净。
如果还聚，就需要控制浓度了，一般来说，浓度对聚合影响很大。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-08-18 11:08:03
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80140333

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小糖精: 金币+5 2015-08-22 10:40:58
你换瓶新的巯基乙醇   在跑胶就没有了
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5楼2015-08-19 11:11:19
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小糖精

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2015-08-17 15:43:59
你的三聚体会带组氨酸吗？如果聚合后会有，你可以用还原SDS再做一下，如果有条带打开，SDS会有反应的。

我做了WB  三聚体地方没带 但是问了其他人说形成三聚体之后组氨酸标记有可能因为构想的改变不在外面了
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6楼2015-08-22 10:36:45
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小糖精

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-08-18 11:08:03
可以加0.5-1mM DTT,或者5-10mM β-ME打开下看看不就知道了么，注意蛋白表达纯化实验时的PH要大于7效果才明显，上NI柱前一定要把游离的NI冲干净。
如果还聚，就需要控制浓度了，一般来说，浓度对聚合影响很大。...

加DTT那个是怎么做呀  因为我做的实验他有效果，我觉着是三聚体也没事  ，就是关键我想知道那是不是三聚体还是杂蛋白
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7楼2015-08-22 10:38:32
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小糖精

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 80140333 at 2015-08-19 11:11:19
你换瓶新的巯基乙醇   在跑胶就没有了

巯基乙醇是直接加到样品里面然后煮样再跑胶么
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8楼2015-08-22 10:40:29
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wolfman840

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小糖精 at 2015-08-22 10:36:45
我做了WB  三聚体地方没带 但是问了其他人说形成三聚体之后组氨酸标记有可能因为构想的改变不在外面了...

那估计你这60KD的不是三聚体。应该是别的东西。
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9楼2015-09-01 13:42:18
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