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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 小小技术官 at 2015-07-30 05:16:43
甘氨酸14.4g tris 3.03g 甲醇150ml  定容到1升
恒压100  电流330mA左右  20分钟
PVDF膜选择孔径0.22微米的
我敢说这种条件如果做不出来  那就是做不出来了

首先非常感谢您的帮助与建议！我们的转膜液是买的半干法转膜液粉状后稀释的。我们的机器一般恒压是25v，电流一般从0.5A开始上，可以上到大约1A，是短时间转膜仪。有时电流不上，总在0.5A左右徘徊，我觉得这跟滤纸的湿度等都有关。时间有时很难把握，有的人23大小的蛋白电流上不到一，11分钟就可转成功。
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11楼2015-07-31 07:02:47
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by 天际雾影 at 2015-07-30 09:32:47
首先，26KD 蛋白不小了，你可以跑12%的胶，用低分子量的MARKER；其次，你的细胞数也太少了吧。转膜时你可以先用marker做个实验，放两块膜试一下正常时间转膜会不会把蛋白转到第二块膜上。你说的电流不稳有可能是你的 ...

放两块膜是个好方法！我想问一下，转完膜后，染了胶观察有没有转上去，结果胶上的maker基本上没了，甚至滤纸上都有，但是在目的条带那块儿的条带在胶上还能很明显的看到，这怎么分析呢？是怎么回事？
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12楼2015-07-31 07:11:42
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by lavender_li at 2015-07-29 16:06:41
200-300个细胞？这么点细胞才能提出来多少蛋白质啊。为什么不多养一点

我养的是卵母细胞，首先样本来就少，其次它不能传代，所以也没办法
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13楼2015-07-31 07:15:24
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-30 04:22:21
完全可以，相同数目细胞具有可比性，但是你细胞数太低，而且你怎么数的200个细胞？细胞计数板单位是*10的4次方，当然你可以数完后用体积确定200个细胞，但是你为什么不多上，真是太少了，这么少的细胞即使做出结果 ...

卵母细胞比较大，显微镜下直接数就可以了。我们的样少，又不能传代，所以细胞数少。
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14楼2015-07-31 07:17:29
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-29 02:24:01
不要闹，你的蛋白可不是小蛋白，26k是非常容易把握的。主要原因是细胞量太少，200-300细胞真的是在玩呢，你上样之前用BCA定量，每个lane至少在10ug才有可能检测出来，当然跟这种蛋白的表达量有关了，如果一直没做出 ...

我还想问一下，做BCA浓度测定时，如果是100-200个细胞，得到总蛋白的量是16-20微升，测浓度的时候应该用多少量比较好？谢谢。
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15楼2015-07-31 07:21:36
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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16楼2015-07-31 07:23:41
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by 1510050322 at 2015-07-29 21:35:27
我之前做的某种蛋白分子量是在12附近，转膜时间为2-2.5h,从来没有出现转过的情况。

我们的仪器恒压是25v，电流一般不稳定从0.5A到1A以上，会增加。
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17楼2015-07-31 07:25:31
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 史密斯丹妮 at 2015-07-31 07:15:24
我养的是卵母细胞，首先样本来就少，其次它不能传代，所以也没办法...

26kDa的蛋白质一般的电泳加转膜应该就可以看到。
但是200-300 个细胞实在太少了，提取出来的蛋白质量少，整个实验结果的误差感觉会很大。
另外蛋白少，电泳的时候上样的量也少，就算转膜接抗体什么全都非常完美，也有可能因为样品太少而检测不到你要的条带。
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18楼2015-07-31 11:15:10
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天际雾影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 史密斯丹妮 at 2015-07-31 07:11:42
放两块膜是个好方法！我想问一下，转完膜后，染了胶观察有没有转上去，结果胶上的maker基本上没了，甚至滤纸上都有，但是在目的条带那块儿的条带在胶上还能很明显的看到，这怎么分析呢？是怎么回事？...

有可能是蛋白量太多了，M过去了你的蛋白肯定也过去了。只是太多的话就没有完全过去。但如果你是用抗体纯化的话，那条你以为是你自己的带很有可能是IgG的轻链，大小24KD。你得先用普通SDS-PAGE检测一下总蛋白里在26KD处对比对照看有没有你的条带。一般纯化的蛋白很难用考染看到的。
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19楼2015-07-31 22:19:22
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