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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 小蛋白WB
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)

[求助] 小蛋白WB 已有5人参与

请求帮助：我的蛋白26KD，需要从200-300个细胞的细胞膜上提取获得，用的是总蛋白提取方法，之前用过专门膜蛋白提取试剂盒，提不出来。有人通过提取总蛋白的方法最后出现结果，但是我总是没有结果。因为细胞量少，蛋白浓度低，蛋白又小，所以希望提供总蛋白的提取改进方法，或者说浓缩方法。再者，转膜时间抓握不好，因为电流不稳定。请问大约这么大的蛋白转多长时间？另外，因为它小很容易转过，所以能不能再转膜时放两次膜？！谢谢！望及时给予帮助
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1楼 2015-07-28 21:18:04
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 史密斯丹妮 at 2015-07-29 15:52:45
有相关操作，比如两个样都取两百个细胞提蛋白，最后上20ul体积的样跑胶，因为细胞数量可知，取得个数又相等，提取的操作过程也基本没误差，所以同上20ul样就相当于上样量相等了，所以也一直没做上样前的BCA定量。...

完全可以，相同数目细胞具有可比性，但是你细胞数太低，而且你怎么数的200个细胞？细胞计数板单位是*10的4次方，当然你可以数完后用体积确定200个细胞，但是你为什么不多上，真是太少了，这么少的细胞即使做出结果也不具有统计性，建议至少2万，何必不做个梯度呢
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7楼2015-07-30 04:22:21
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不要闹，你的蛋白可不是小蛋白，26k是非常容易把握的。主要原因是细胞量太少，200-300细胞真的是在玩呢，你上样之前用BCA定量，每个lane至少在10ug才有可能检测出来，当然跟这种蛋白的表达量有关了，如果一直没做出来不如再加大上样量，40ug试试。至于你怀疑WB的过程，上个预染marker不就好了
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2楼2015-07-29 02:24:01
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-29 02:24:01
不要闹，你的蛋白可不是小蛋白，26k是非常容易把握的。主要原因是细胞量太少，200-300细胞真的是在玩呢，你上样之前用BCA定量，每个lane至少在10ug才有可能检测出来，当然跟这种蛋白的表达量有关了，如果一直没做出 ...

有相关操作，比如两个样都取两百个细胞提蛋白，最后上20ul体积的样跑胶，因为细胞数量可知，取得个数又相等，提取的操作过程也基本没误差，所以同上20ul样就相当于上样量相等了，所以也一直没做上样前的BCA定量。
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3楼2015-07-29 15:52:45
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
200-300个细胞？这么点细胞才能提出来多少蛋白质啊。为什么不多养一点
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4楼2015-07-29 16:06:41
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