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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 小蛋白WB
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)

[求助] 小蛋白WB 已有5人参与

请求帮助：我的蛋白26KD，需要从200-300个细胞的细胞膜上提取获得，用的是总蛋白提取方法，之前用过专门膜蛋白提取试剂盒，提不出来。有人通过提取总蛋白的方法最后出现结果，但是我总是没有结果。因为细胞量少，蛋白浓度低，蛋白又小，所以希望提供总蛋白的提取改进方法，或者说浓缩方法。再者，转膜时间抓握不好，因为电流不稳定。请问大约这么大的蛋白转多长时间？另外，因为它小很容易转过，所以能不能再转膜时放两次膜？！谢谢！望及时给予帮助
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1楼 2015-07-28 21:18:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不要闹，你的蛋白可不是小蛋白，26k是非常容易把握的。主要原因是细胞量太少，200-300细胞真的是在玩呢，你上样之前用BCA定量，每个lane至少在10ug才有可能检测出来，当然跟这种蛋白的表达量有关了，如果一直没做出来不如再加大上样量，40ug试试。至于你怀疑WB的过程，上个预染marker不就好了
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2楼2015-07-29 02:24:01
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
200-300个细胞？这么点细胞才能提出来多少蛋白质啊。为什么不多养一点
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4楼2015-07-29 16:06:41
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的细胞量确实太少，提取的蛋白量也很少，有可能WB根本就检测不出来。WB转膜100v 100分钟，就可以
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5楼2015-07-29 16:46:34
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1510050322

银虫 (初入文坛)
我之前做的某种蛋白分子量是在12附近，转膜时间为2-2.5h,从来没有出现转过的情况。
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6楼2015-07-29 21:35:27
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 天际雾影 at 2015-07-30 09:32:47
首先，26KD 蛋白不小了，你可以跑12%的胶，用低分子量的MARKER；其次，你的细胞数也太少了吧。转膜时你可以先用marker做个实验，放两块膜试一下正常时间转膜会不会把蛋白转到第二块膜上。你说的电流不稳有可能是你的 ...

放两块膜是个好方法！我想问一下，转完膜后，染了胶观察有没有转上去，结果胶上的maker基本上没了，甚至滤纸上都有，但是在目的条带那块儿的条带在胶上还能很明显的看到，这怎么分析呢？是怎么回事？
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12楼2015-07-31 07:11:42
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 史密斯丹妮 at 2015-07-31 07:15:24
我养的是卵母细胞，首先样本来就少，其次它不能传代，所以也没办法...

26kDa的蛋白质一般的电泳加转膜应该就可以看到。
但是200-300 个细胞实在太少了，提取出来的蛋白质量少，整个实验结果的误差感觉会很大。
另外蛋白少，电泳的时候上样的量也少，就算转膜接抗体什么全都非常完美，也有可能因为样品太少而检测不到你要的条带。
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18楼2015-07-31 11:15:10
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普通回帖

史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-29 02:24:01
不要闹，你的蛋白可不是小蛋白，26k是非常容易把握的。主要原因是细胞量太少，200-300细胞真的是在玩呢，你上样之前用BCA定量，每个lane至少在10ug才有可能检测出来，当然跟这种蛋白的表达量有关了，如果一直没做出 ...

有相关操作，比如两个样都取两百个细胞提蛋白，最后上20ul体积的样跑胶，因为细胞数量可知，取得个数又相等，提取的操作过程也基本没误差，所以同上20ul样就相当于上样量相等了，所以也一直没做上样前的BCA定量。
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3楼2015-07-29 15:52:45
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 史密斯丹妮 at 2015-07-29 15:52:45
有相关操作，比如两个样都取两百个细胞提蛋白，最后上20ul体积的样跑胶，因为细胞数量可知，取得个数又相等，提取的操作过程也基本没误差，所以同上20ul样就相当于上样量相等了，所以也一直没做上样前的BCA定量。...

完全可以，相同数目细胞具有可比性，但是你细胞数太低，而且你怎么数的200个细胞？细胞计数板单位是*10的4次方，当然你可以数完后用体积确定200个细胞，但是你为什么不多上，真是太少了，这么少的细胞即使做出结果也不具有统计性，建议至少2万，何必不做个梯度呢
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7楼2015-07-30 04:22:21
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
甘氨酸14.4g tris 3.03g 甲醇150ml  定容到1升
恒压100  电流330mA左右  20分钟
PVDF膜选择孔径0.22微米的
我敢说这种条件如果做不出来  那就是做不出来了

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生活是一面镜子，要笑着面对！
8楼2015-07-30 05:16:43
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天际雾影

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，26KD 蛋白不小了，你可以跑12%的胶，用低分子量的MARKER；其次，你的细胞数也太少了吧。转膜时你可以先用marker做个实验，放两块膜试一下正常时间转膜会不会把蛋白转到第二块膜上。你说的电流不稳有可能是你的转膜缓冲液时间太长了，配个新的试试。
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9楼2015-07-30 09:32:47
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史密斯丹妮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lavender_li at 2015-07-29 16:06:41
200-300个细胞？这么点细胞才能提出来多少蛋白质啊。为什么不多养一点

我培养的是卵母细胞，首先本来送来的样就少，其次它不能传代，所以只有少没有多
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10楼2015-07-31 06:45:58
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