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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物无法完全测序
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小小雨儿飞

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物无法完全测序 已有2人参与

PCR产物无法完全测序，我的序列是137bp,测序得到109bp，什么情况啊？初入分子生物学，不太懂，求指点
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遇见未知的自己
1楼 2015-07-27 19:50:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

表弟爱网游

金虫 (小有名气)
片段太短，测序最开始的几十个碱基会很不准确（引物区序列不准），所以你得到的结果会跟你期望的片段长度有一点差别。建议你连一个载体之后再测序，这样准确率会高很多。只要你的PCR样品长度大于400bp，只要浓度够，直接测序问题不大的。小于200bp，最好连载体，用通用引物测序。
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当一切如飞舞的落叶坠落，惋惜之余，也要学会原谅与释怀
8楼2015-07-29 11:37:18
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neon_alone

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小小雨儿飞: 金币+3 2015-07-28 16:51:57
你是直接测序PCR产物的吗？如果是的话，你自己的引物作为测序引物，前面是测不到，建议连接到T载体测序一下。
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3楼2015-07-28 16:41:41
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小小雨儿飞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by neon_alone at 2015-07-28 16:41:41
你是直接测序PCR产物的吗？如果是的话，你自己的引物作为测序引物，前面是测不到，建议连接到T载体测序一下。

哦哦，这样啊，好的。是不是所有都测序如果要测完整都要T载体连接？
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遇见未知的自己
5楼2015-07-28 16:51:53
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)
连接测序比较准啊

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6楼2015-07-28 21:46:38
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-28 22:56:52
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小小雨儿飞 at 2015-07-28 16:51:53
哦哦，这样啊，好的。是不是所有都测序如果要测完整都要T载体连接？...

你也可以选择双向测序，这样就不用连载体了。如果只是想知道序列，建议双向测序，把你的上下游引物都给测序公司。如果后续要做功能验证分析，那还是连载体再测，反正后面也要做这步。
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7楼2015-07-28 22:39:16
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小小雨儿飞: 金币+2 2015-07-28 16:50:35
是连到载体上测的吗？
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2楼2015-07-28 14:52:20
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小小雨儿飞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-07-28 14:52:20
是连到载体上测的吗？

是PCR产物切胶回收后送测的
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遇见未知的自己
4楼2015-07-28 16:50:26
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bigvally

新虫 (初入文坛)
连T或者有测序引物的表达载体后测序
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9楼2015-07-29 17:19:48
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见神一笑

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 表弟爱网游 at 2015-07-29 11:37:18
片段太短，测序最开始的几十个碱基会很不准确（引物区序列不准），所以你得到的结果会跟你期望的片段长度有一点差别。建议你连一个载体之后再测序，这样准确率会高很多。只要你的PCR样品长度大于400bp，只要浓度够， ...

正解

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好好努力
10楼2015-07-29 17:29:58
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