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melani1983

铁虫 (初入文坛)

[求助] western blot 求助已有8人参与

各位大神好!本人小博一名,最近做Western blot 转膜一直不稳定,market有时候也不清晰,转膜条件 230mA 恒流 100min,对应电压大概是110v左右,转膜液配方:配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。提前预冷1个小时以上。附图一张,请大神指导。

western blot 求助
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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melani1983(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-24 10:21:40
胶配的不好吧,不同样品之间有点串了。
3楼2015-07-24 09:29:18
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melani1983

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by veryonly at 2015-07-24 21:46:27
你这明明是胶的问题,和转膜过程没关系

哦,是胶没凝好还是怎样?谢谢!
12楼2015-07-25 15:45:47
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探花花

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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melani1983(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-24 10:21:34
感觉像是胶的问题。但是Marker也没有跑出来,有点诡异的感觉
相信什么才会得到什么
2楼2015-07-23 23:09:35
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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melani1983(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-07-24 10:21:49
蛋白分子量很大吗?个人觉得可以不用加SDS。转膜效果不好可能是你的buffer有些问题,可以调整下试试
4楼2015-07-24 09:44:29
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melani1983

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 探花花 at 2015-07-23 23:09:35
感觉像是胶的问题。但是Marker也没有跑出来,有点诡异的感觉

是胶凝的不好吗?
5楼2015-07-24 20:04:50
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melani1983

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-07-24 09:44:29
蛋白分子量很大吗?个人觉得可以不用加SDS。转膜效果不好可能是你的buffer有些问题,可以调整下试试

您好!提供的图片分子量大概是42KD。同样的一张膜孵育其他抗体,也有显的还可以的。转膜液不加SDS的话,配方应该是怎样的?谢谢!
western blot 求助-1
SIRT6-3.jpg

6楼2015-07-24 20:11:47
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veryonly

禁虫 (著名写手)

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本帖内容被屏蔽

7楼2015-07-24 21:46:27
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yuhp09

铁杆木虫 (正式写手)

转膜液不加SDS,我们这边,感觉是胶没配好

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2015-07-24 22:18:09
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kes7799

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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您試試 1 L 加 tris 3.4g ; glycine 15g 不用加SDS。甲醇170 ml。如果是NC paper不用活化,如果是pvdf先用甲醇活化3 min再進行轉製。
9楼2015-07-25 08:54:28
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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楼主传的是什么的图片?膜接了抗体之后拍的照片么?
那胶呢?转膜之后,胶染色了么?胶什么情况
10楼2015-07-25 10:19:02
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