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yhpzcx

铁虫 (小有名气)

[求助] 500KD左右蛋白的WB该怎么做!!! 已有3人参与

最近在做500KD大小的WB,做了几次都没有想要的条带?
我的条件是
6%分离胶,4%浓缩胶跑的,大约跑了4h
转膜
0.45PVDF    10%甲醇  0.1%SDS转膜液
一直没有想要的条带
不知论坛里的大神们,有没有做过类似大小的蛋白,给小弟指点迷津
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
500KD大小的SDS PAGE 电泳的脚就很稀,如果6%分离胶,4%浓缩胶跑的,大约跑了4h能够成功的话,恐怕会有不少的蛋白质会穿透凝胶。建议作SDS PAGE 电泳之前先用分子筛充分去除咋蛋白质。

然后在转膜时用事发转膜,用100V恒压400mA,转3-4小时试试看。

但是我觉得如此大的蛋白质做WB检测根部不合适,因该改变试验方法,楼主的实验目的是什么?
6楼2015-07-16 13:24:23
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yhpzcx: 金币+5, ★★★很有帮助, 按这条件转了下,可以转上,不过把层析柜弄坏了。。。。 2015-07-21 17:04:29
以前做过一个原核蛋白表达的530kd蛋白,条件跟你的一样,不知道你的转膜时间是多少,我的是300ma,低温过夜,在冷室或层析柜里做。
最后,什么叫没有想要的条带,是什么条带都没有?还是说只是没有目的蛋白的条带?
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
2楼2015-07-15 09:27:37
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yhpzcx

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-15 09:27:37
以前做过一个原核蛋白表达的530kd蛋白,条件跟你的一样,不知道你的转膜时间是多少,我的是300ma,低温过夜,在冷室或层析柜里做。
最后,什么叫没有想要的条带,是什么条带都没有?还是说只是没有目的蛋白的条带?...

非常感谢回复,我的转膜时间是14v转了18h。
没有目的蛋白的条带
因为是细胞样本,可能表达量不是太高
不知您,最后做出来了么
3楼2015-07-15 10:54:00
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yhpzcx at 2015-07-15 10:54:00
非常感谢回复,我的转膜时间是14v转了18h。
没有目的蛋白的条带
因为是细胞样本,可能表达量不是太高
不知您,最后做出来了么...

嗯,重复了3次吧,最后做出来了。你的估计应该是样品的问题,大分子蛋白很容易降解的。
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
4楼2015-07-15 16:55:28
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