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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 500KD左右蛋白的WB该怎么做！！！
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yhpzcx

铁虫 (小有名气)

[求助] 500KD左右蛋白的WB该怎么做！！！ 已有3人参与

最近在做500KD大小的WB，做了几次都没有想要的条带？
我的条件是
6%分离胶，4%浓缩胶跑的，大约跑了4h
转膜
0.45PVDF    10%甲醇  0.1%SDS转膜液
一直没有想要的条带
不知论坛里的大神们，有没有做过类似大小的蛋白，给小弟指点迷津
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1楼 2015-07-14 17:11:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
500KD大小的SDS PAGE 电泳的脚就很稀，如果6%分离胶，4%浓缩胶跑的，大约跑了4h能够成功的话，恐怕会有不少的蛋白质会穿透凝胶。建议作SDS PAGE 电泳之前先用分子筛充分去除咋蛋白质。

然后在转膜时用事发转膜，用100V恒压400mA，转3-4小时试试看。

但是我觉得如此大的蛋白质做WB检测根部不合适，因该改变试验方法，楼主的实验目的是什么？
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6楼2015-07-16 13:24:23
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普通回帖

恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yhpzcx: 金币+5, ★★★很有帮助, 按这条件转了下，可以转上，不过把层析柜弄坏了。。。。 2015-07-21 17:04:29
以前做过一个原核蛋白表达的530kd蛋白，条件跟你的一样，不知道你的转膜时间是多少，我的是300ma，低温过夜，在冷室或层析柜里做。
最后，什么叫没有想要的条带，是什么条带都没有？还是说只是没有目的蛋白的条带？
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-07-15 09:27:37
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yhpzcx

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-15 09:27:37
以前做过一个原核蛋白表达的530kd蛋白，条件跟你的一样，不知道你的转膜时间是多少，我的是300ma，低温过夜，在冷室或层析柜里做。
最后，什么叫没有想要的条带，是什么条带都没有？还是说只是没有目的蛋白的条带？...

非常感谢回复，我的转膜时间是14v转了18h。
没有目的蛋白的条带
因为是细胞样本，可能表达量不是太高
不知您，最后做出来了么
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3楼2015-07-15 10:54:00
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yhpzcx at 2015-07-15 10:54:00
非常感谢回复，我的转膜时间是14v转了18h。
没有目的蛋白的条带
因为是细胞样本，可能表达量不是太高
不知您，最后做出来了么...

嗯，重复了3次吧，最后做出来了。你的估计应该是样品的问题，大分子蛋白很容易降解的。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-07-15 16:55:28
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
低浓度胶，转膜时间要长~~~
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5楼2015-07-16 06:31:34
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yhpzcx

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2015-07-16 13:24:23
500KD大小的SDS PAGE 电泳的脚就很稀，如果6%分离胶，4%浓缩胶跑的，大约跑了4h能够成功的话，恐怕会有不少的蛋白质会穿透凝胶。建议作SDS PAGE 电泳之前先用分子筛充分去除咋蛋白质。

然后在转膜时用事发转膜， ...

谢谢，指点。我的目的是筛选出比较合适的细胞，根据1楼的建议，现在能做出条带了，谢谢。
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7楼2015-07-21 17:00:17
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yhpzcx

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-07-15 16:55:28
嗯，重复了3次吧，最后做出来了。你的估计应该是样品的问题，大分子蛋白很容易降解的。...

换着条件摸索了4次，终于有条带了，不过很丑，我在改进下！
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8楼2015-07-21 17:02:01
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yhpzcx at 2015-07-21 17:02:01
换着条件摸索了4次，终于有条带了，不过很丑，我在改进下！...

祝你成功
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
9楼2015-07-22 08:46:32
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邻家小妹

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yhpzcx at 2015-07-15 10:54:00
非常感谢回复，我的转膜时间是14v转了18h。
没有目的蛋白的条带
因为是细胞样本，可能表达量不是太高
不知您，最后做出来了么...

你是怎么做出来的，可以跟我分享下你的方法么，我最近也在做这个 做不出来
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10楼2016-05-27 12:07:37
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