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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] 急!急!农杆菌AGL1转化遇到问题,做过农杆菌转化的进 已有2人参与

做农杆菌AGL1(买的感受态),做转化,
加质粒,冰浴,液氮速冻5min,在37摄氏度水浴 5min,再冰浴5min,
加无抗生素的 LB 200 r/min孵育2-4h,
最后离心,留100微升悬液涂布于50微克每毫升的含利福平的LB平板。
28摄氏度培养,
说明书是培养2-3d,可是培养24h,就已经长出一片了,无单菌落啊,
这是怎么回事啊?是因为菌体浓度太高吗?
后来再做一次,操作与上述一样,最后过夜培养12h,AGL1在LB平板(含利福平)还是长成一片。
求经验的人指导啊
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无所谓好或不好,人生一场虚空大梦,韶华白首,不过转瞬,惟有天道恒在,往复循环,不曾更改
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
uuu555000: 金币+2 2015-06-23 13:46:43
载体什么抗性,只加利福平肯定长成一片

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-06-22 21:33:25
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
uuu555000: 金币+1 2015-06-23 13:46:37
1.加抗性,同楼上;2.看看染菌没。另外,问下,感受态的农杆菌AGL1哪儿买的?
工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
3楼2015-06-23 09:22:57
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by orangeleaf at 2015-06-23 09:22:57
1.加抗性,同楼上;2.看看染菌没。另外,问下,感受态的农杆菌AGL1哪儿买的?

博迈德
无所谓好或不好,人生一场虚空大梦,韶华白首,不过转瞬,惟有天道恒在,往复循环,不曾更改
4楼2015-06-23 13:37:38
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-06-22 21:33:25
载体什么抗性,只加利福平肯定长成一片

只有载体的部分信息,有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的,在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo??
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因,那么假如将该载体导入真菌后筛选时,可用G418吗?
含有Neo抗性基因就能抗G418吗?
无所谓好或不好,人生一场虚空大梦,韶华白首,不过转瞬,惟有天道恒在,往复循环,不曾更改
5楼2015-06-23 13:46:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by uuu555000 at 2015-06-23 13:46:30
只有载体的部分信息,有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的,在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo??
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因,那么假如将该载体导入真菌后筛选时,可用G418吗?
含 ...

你用的不是大肠杆菌的抗性吧

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2015-06-23 14:04:07
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-06-23 14:04:07
你用的不是大肠杆菌的抗性吧
...

这个载体是别人给的,载体信息不全,以你的经验看是这个载体是Amp
和Neo这2个抗性标记?
无所谓好或不好,人生一场虚空大梦,韶华白首,不过转瞬,惟有天道恒在,往复循环,不曾更改
7楼2015-06-23 18:59:30
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)

我这个也是长了一大片,没法挑单菌落,我刚画的单菌落,但是长出来还是一片,老师说那就一直画单菌落吧
生而必争朝夕,活而必尽善美
8楼2015-07-09 17:18:52
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
uuu555000: 金币+3 2015-07-10 17:16:34
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2015-07-10 18:06:32
我做的,kan抗性,仅供参考:
我自己做农杆菌AGL1的感受态
做转化,
加质粒,冰浴30min,液氮速冻1min,在37摄氏度水浴 3min,再冰浴1.5min,
加无抗生素的0.5mL LB 100 r/min孵育3h,
最后离心,留150微升悬液涂布于含kan的LB平板。
28摄氏度培养,
培养2d,(培养24h没有长出单菌落)
工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
9楼2015-07-10 14:18:32
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花间鹿666

新虫 (初入文坛)

请问你的问题找到原因了吗?我最近叶遇到这个问题,农杆菌涂在含氨苄和利福平的板子上,第二天就长满菌,看不到单菌落,各种原因都排查,没找到原因
justlikethesky...
10楼2016-01-26 11:07:53
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