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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 急！急！农杆菌AGL1转化遇到问题，做过农杆菌转化的进
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] 急！急！农杆菌AGL1转化遇到问题，做过农杆菌转化的进 已有2人参与

做农杆菌AGL1（买的感受态），做转化，
加质粒，冰浴，液氮速冻5min，在37摄氏度水浴 5min，再冰浴5min，
加无抗生素的 LB 200 r/min孵育2-4h，
最后离心，留100微升悬液涂布于50微克每毫升的含利福平的LB平板。
28摄氏度培养，
说明书是培养2-3d，可是培养24h，就已经长出一片了，无单菌落啊，
这是怎么回事啊？是因为菌体浓度太高吗？
后来再做一次，操作与上述一样，最后过夜培养12h，AGL1在LB平板（含利福平）还是长成一片。
求经验的人指导啊
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无所谓好或不好，人生一场虚空大梦，韶华白首，不过转瞬，惟有天道恒在，往复循环，不曾更改
1楼 2015-06-22 18:38:59
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
uuu555000: 金币+2 2015-06-23 13:46:43
载体什么抗性，只加利福平肯定长成一片

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2楼2015-06-22 21:33:25
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
uuu555000: 金币+1 2015-06-23 13:46:37
1.加抗性，同楼上；2.看看染菌没。另外，问下，感受态的农杆菌AGL1哪儿买的？
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工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
3楼2015-06-23 09:22:57
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
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3楼: Originally posted by orangeleaf at 2015-06-23 09:22:57
1.加抗性，同楼上；2.看看染菌没。另外，问下，感受态的农杆菌AGL1哪儿买的？

博迈德
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无所谓好或不好，人生一场虚空大梦，韶华白首，不过转瞬，惟有天道恒在，往复循环，不曾更改
4楼2015-06-23 13:37:38
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-06-22 21:33:25
载体什么抗性，只加利福平肯定长成一片

只有载体的部分信息，有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的，在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo？？
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因，那么假如将该载体导入真菌后筛选时，可用G418吗？
含有Neo抗性基因就能抗G418吗？
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无所谓好或不好，人生一场虚空大梦，韶华白首，不过转瞬，惟有天道恒在，往复循环，不曾更改
5楼2015-06-23 13:46:30
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by uuu555000 at 2015-06-23 13:46:30
只有载体的部分信息，有TrpC启动子+GFP+TrpC终止子+Neo的，在是不是在LB培养基中加入利福平和Neo？？
还想问一个问题这个载体目前只知道的信息有Neo抗性基因，那么假如将该载体导入真菌后筛选时，可用G418吗？
含 ...

你用的不是大肠杆菌的抗性吧

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2015-06-23 14:04:07
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-06-23 14:04:07
你用的不是大肠杆菌的抗性吧
...

这个载体是别人给的，载体信息不全，以你的经验看是这个载体是Amp
和Neo这2个抗性标记？
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无所谓好或不好，人生一场虚空大梦，韶华白首，不过转瞬，惟有天道恒在，往复循环，不曾更改
7楼2015-06-23 18:59:30
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)
我这个也是长了一大片，没法挑单菌落，我刚画的单菌落，但是长出来还是一片，老师说那就一直画单菌落吧
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生而必争朝夕，活而必尽善美
8楼2015-07-09 17:18:52
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
uuu555000: 金币+3 2015-07-10 17:16:34
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2015-07-10 18:06:32
我做的，kan抗性，仅供参考：
我自己做农杆菌AGL1的感受态
做转化，
加质粒，冰浴30min，液氮速冻1min，在37摄氏度水浴 3min，再冰浴1.5min，
加无抗生素的0.5mL LB 100 r/min孵育3h，
最后离心，留150微升悬液涂布于含kan的LB平板。
28摄氏度培养，
培养2d，(培养24h没有长出单菌落）
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工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
9楼2015-07-10 14:18:32
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花间鹿666

新虫 (初入文坛)
请问你的问题找到原因了吗？我最近叶遇到这个问题，农杆菌涂在含氨苄和利福平的板子上，第二天就长满菌，看不到单菌落，各种原因都排查，没找到原因
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justlikethesky...
10楼2016-01-26 11:07:53
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