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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aoaoshch at 2015-06-17 10:47:06
感觉PCR体系可以适当调整一下：
引物0.5 ul、0.25 ul、0.25 ul
模版10 ng
LA Taq 0.4 ul
98℃变性10 s，62℃退火20 s，延伸10 min

可以再试试哈

我的是长距离PCR，反应条件和温度跟这个不一样

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11楼2015-06-17 15:40:21
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xu7462231 at 2015-06-17 11:00:20
我可以告诉你是由于你提取DNA没提好，有一步是加NaOH为了溶解细胞，你这一步要不剧烈振荡了要不就是时间太长，强碱会使DNA断裂成大小不一的片段而导致你拖尾。 你退火温度是68  是不是高了点呢？  一般是TM值减5°  ...

好吧，就怕是模板DNA的问题，我再提取新的标本去看看。可是我用的是酚氯法提人血标本DNA的。。。

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12楼2015-06-17 15:43:08
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zhqingfang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
琼脂糖凝胶浓度太小了，改用2%的浓度试试看
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实验忙碌中
13楼2015-06-17 16:46:42
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hx10205

银虫 (小有名气)
换引物
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14楼2015-06-17 18:38:02
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wangs2004

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
乍一看我以为日光灯呢,LZ的模板是不是坏掉了
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15楼2015-06-17 19:43:26
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 王小燕30 at 2015-06-17 15:40:21
我的是长距离PCR，反应条件和温度跟这个不一样
...

为什么要我试试这个条件呢？有没有特别的原因哦，我跑的是长片段，看起来似乎不太一样
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16楼2015-06-17 22:10:19
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by wangs2004 at 2015-06-17 19:43:26
乍一看我以为日光灯呢,LZ的模板是不是坏掉了

估计是模版不好了
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17楼2015-06-17 22:13:11
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhqingfang at 2015-06-17 16:46:42
琼脂糖凝胶浓度太小了，改用2%的浓度试试看

这个胶的浓度可以跑出我的marker呢，
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18楼2015-06-17 22:14:26
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by hx10205 at 2015-06-17 18:38:02
换引物

为什么
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19楼2015-06-17 22:16:34
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-17 22:50:17
这个图。。。。。。。太壮观了，倚天出鞘啊！
言归正传。你这个应该是胶的问题，即使PCR失败或者模板有问题也不应该是这种情况；建议按如下步骤排查：
1、直接用模板DNA跑电泳或者其他正常扩增的小片段PCR产物（小于2000 bp）跑电泳（可以在同一块胶上加你的长片段PCR产物），如果所有泳道均是上述情况，那么你的胶有问题了。可能原因：胶里面混有大量杂质DNA、胶配制有问题、冷凝时间太短等等。
2、PCR可能的问题，如果操作、试剂和程序没有问题，就是引物特异性太差，导致产物大小不等，不过这个几率非常小。

胶的问题可能性比较大。
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没有做不到，只有想不到！
20楼2015-06-17 22:27:18
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