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王小燕30

铜虫 (小有名气)

[求助] 跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢 已有11人参与

应该跑出目的条带的，可是一直是拖尾，从加样孔就开始拖。。。。怎么办，是什么问题呢希望各位大哥大姐路过的看过的给指点指点哦

跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢
IMG_20150610_124807.jpg


跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢-1
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跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢-2
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1楼 2015-06-16 14:52:51
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xu7462231

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
王小燕30(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-17 22:48:21
我可以告诉你是由于你提取DNA没提好，有一步是加NaOH为了溶解细胞，你这一步要不剧烈振荡了要不就是时间太长，强碱会使DNA断裂成大小不一的片段而导致你拖尾。 你退火温度是68  是不是高了点呢？  一般是TM值减5°  。
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10楼2015-06-17 11:00:20
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请提供反应体系和程序。让大家参考参考
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2楼2015-06-16 20:19:10
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mangool

新虫 (初入文坛)
有可能是提取核酸的纯度不好
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3楼2015-06-16 20:33:08
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-06-16 20:19:10
请提供反应体系和程序。让大家参考参考

我做的是长距离PCR，要跑出的条带是12000和11000，就是应该是电泳图上最上边两条marker之间的条带。一直是拖尾。
三条引物是：（上游引物）P：5’一GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3’
（下游引物）Q：5'-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3’
（下游引物）B：5’-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CATA-3’；
反应体系：引物P、Q、B(20 pmol／ul)分别2ul、1ul、1ul，模板基因组DNA 2ul(约100 ng)，TaKaRa LA Taq酶0．25ul(5 U／ul)，2×GC缓冲液I 12．5ul，dNTP 4ul，蒸馏水补足，总反应体积25ul。
反应条件：94℃预变性2 min，前10个循环98℃变性10 s，68℃退火／延伸10 min，后20个循环98℃变性10 s，68℃延伸10 min 20s，共进行30个循环。电泳：配制6g/L琼脂糖凝胶，PCR产物5ul与6×上样缓冲液1ul混匀上样，在恒压75 V电泳，成像
我就是想问问这样拖带可能跟什么关系最大



我做的时候就一直在变化引物浓度比例，和退火温度。用梯度PCR仪做过，退火温度从65、66、-69、70，也没什么明显的结果条带哦
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4楼2015-06-16 21:55:43
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